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L'extraction des ARN totaux à partir d'échantillons de tissus congelés est faite manuellement au Trizol. 2. Personnel. Les extractions d'ARN sont effectuées par
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Les extractions d'ARN sont effectuées par les techniciens de laboratoire de la Plateforme de. Ressources Biologiques qui sont formés et habilités à fréquence
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Page 1
N1. Equipements utilisés
de tissus fixés au formol et inclus en paraffine ® (Promega, Lyon,France). Cet appareil bénéfi
au Trizol.2. Personnel
LeN sont effectuées par les techniciens de laboratoire de la Plateforme deRessources Biologiques qui sont formés et habilités à fréquence régulière sur chaque
technique spécifiquement.Page 2
3. Matrices prises en charge
® perm
Matrice Sang total Tissus Urine
Support du
prélèvement PAXgene®* Tempus®**Congélation
immédiate en azote puis conservationà -80°C*
Fixation au formol
et inclusion en paraffine puis conservation à température ambianteNorgen®*;
Falcon®*
2,5 mL* 3,0 mL** 10 coupes
de 50 µm*2 coupes
de 5 µm* 50 mL*Nature Congelé
(< 1 mois à -80°C)*Congelé
(< 1 mois à -80°C)** Congelé (-80°C)* Température ambiante* Frais (< 1 mois)*50 µL* 50 µL** 10 à 50 µL* 50 µL* 30 µL*
Eau nucléase-free Eau nucléase-free Eau nucléase-free Eau nucléase-free Eau nucléase-free Technique Maxwell 16® Maxwell 16® Manuelle Maxwell 16® Maxwell 16® Délai technique interne 2 heures 2 heures 4 heures 4 heures 2 heures *validation fournisseur +validation en interne, **validation fournisseur uniquementPoints de vigilance :
- Congélation des tubes PAXgene® : les tubes PAXgene® doivent être congelés en position verticale pendant 24 heures à --80°C.4. Contrôles qualité dispoN obtenus
La qualitN obtenu
aval e Ressources Biologiques accorde une grande importance aux contrôles qualité réN extraits. Les différentscontrôles qualité décrits ci-dessous sont disponibles et peuvent être réalisés sur demande.
- Dosage spectrophotométrique (Nanodrop 2000®) La mesure du rapport de DO 260/280 permet donc de contrôler la pureté des échantillonsPage 3
N obtenus en évaluant la présence de contaminants (solvants organiques, protéines résiduelles) dN.On attend un rapport 260/2N pur. Un rapport
plus faible traduit généralement une contamination en protéines. - Dosage fluorimétrique (Quantus®, Qubit®) Il existe des méthodes fluorimétriques N qui sont basées laN présente. Cette technique est tN, plus
sensible et plus spécifique que le dosage spectrophotométrique. avoir suffisamment de matériel pour toutes les applications prévues en aval. - ENLa technologie Agilent®
comprise de 1 à 10, un RIN de 10 correspondant à un ARN de qualité parfaite et un RIN de 1 correspondant à un ARN totalement dégradé. validées . volume de la matrice initiale utilisé en mL ou mg. Le nucléiques. Cette donnée est essentielle car elle permet dN obtenue doit être suffisante pour les applications en aval. La Plateforme de Ressources Biologiques a soigneusement validé les différentes techniques applications en aval souhaitées par les chercheurs.Page 4
5. Performances attendues
Le tableau ci-
Rapport DO
260/280
Concentration
des ARN Score RIN RendementSang total sur
PAXgene >1,7 > 50 ng/µL > 7,0 2267 ng / mL
de sang totalSang total sur
Tempus >1,7 > 50 ng/µL > 7,0 2993 ng / mL
de sang totalTissus congelés >1,6 > 50 ng/µL > 6,0 47
de tissuTissus fixés au
formol et inclus en paraffine >1,6 > 20 ng/µLNon pertinent
ARN très
dégradés790 ng dARN / µm
de tissuUrine >1,4 > 4 ng/µL > 2,0 8 N / mL
6. Conclusion
RN int sont compatibles avec les applications prévue en aval, telles que la RT-PCR, la qRT-PCR et le northern blotting.L'ensemble des résultats générés lors de la mise au point et de la validation des techniques
Rorme de Ressources Biologiques fait l'objet
RN est ensuite
clairement décrite sous forme d'un mode opératoire standardisé.Mise à jour : mai 2017
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