[PDF] Comparaison de trois méthodes analytiques (sonde fluorimétrique

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Comparaison de trois

méthodes analytiques (sonde fluorimétrique, spectroscopie

UV-visible et HPLC) pour le

dosage de la chlorophylle a dans les eaux de trois lacs

Août 2009

Julie Roussille

Responsables de stage :

Christophe Laplace-Treyture

Nicolas Mazzella

Cemagref

Unité de Recherche Réseaux, Epuration et

Qualité des Eaux

50, avenue de Verdun

F-33612 Cestas cedex CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

2CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

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Remerciements

Si mon stage s'est bien déroulé, c'est

que de nombreuses personnes ont été très présentes et se sont montrées disponibles pour moi. Je remercie tout d'abord Christophe Laplace et Nicolas Mazzella qui ont pris beaucoup de leur temps pour m'encadrer tout au long du stage, me conseiller et me transmettre leurs nombreuses connaissances. Je remercie ensuite toute l'équipe de chimie, les plus jeunes comme les moins jeunes (Sophie Lissalde, Vincent Fauvelle, Nhu Trang Tran Thi et les techniciennes Brigitte " s »

Méchin et Delest, Maryse Boudigues et Murielle

Bonnet) pour tous les conseils et " trucs et

astuces » que chacun m'a appris, la confiance qu'ils m'ont accordée ainsi que la bonne

ambiance qu'ils apportaient dans l'équipe et qui me motivait pour travailler. Leur aide m'a été

très précieuse. Je remercie aussi Sylvia Moreira qui m'a accompagné sur le terrain toutes les semaines, m'a supporté, m'a fait confiance, m'a aidé et m'a beaucoup conseillé. Je remercie enfin les autres membres du Cemagref (documentalistes, statisticiens,

personnel de l'accueil, etc.) qui m'ont aidé à faire avancer mon sujet et rapport de stage et les

stagiaires (dont la liste est bien longue) avec qui j'ai passé de très bons moments. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

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Sommaire

1 Généralités..........................................................................................................................7

2 Matériel et méthodes........................................................................................................10

2.1 Terrain......................................................................................................................10

2.2 Tests in situ...............................................................................................................11

2.3 Tests en laboratoire ..................................................................................................12

2.3.1 La spectrophotométrie UV-visible (spectrométrie d'absorption moléculaire) 12

2.3.2 La chromatographie liquide à haute pression...................................................13

3 Résultats et discussion......................................................................................................18

3.1 Développement de la méthode HPLC......................................................................18

3.2 Validation de la méthode HPLC ..............................................................................21

3.2.1 Principe.............................................................................................................21

3.2.2 Résultats de la validation de la méthode HPLC...............................................23

3.3 Comparaison des différentes techniques d'analyses................................................25

3.4 Etude des lacs et groupes algaux d'après les pigments............................................32

Conclusion

Bibliographie

AnnexesCemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref 5

Liste des tableaux

Tableau 1: Pigments présents dans les groupes algaux identifiables.........................................8

Tableau 2: Longueurs d'onde d'absorption dans l'UV-visible pour les pigments quantifiés......8

Tableau 3: Composition des solvants utilisés en HPLC ..........................................................15

Tableau 4: Programmation du gradient d'élution.....................................................................15

Tableau 5: Longueurs d'onde utilisées pour la détection des pigments en UV-visible et Tableau 6: Volumes prélevés pour préparer la solution fille de concentration 1 mg.L -1 .........17 Tableau 7: Temps de rétention des pigments recherchés par détection UV-visible et Tableau 8: Longueurs d'onde d'absorption trouvées dans la littérature et longueurs d'onde

d'excitation et émission déterminées à l'aide des premières.....................................................19

Tableau 9: Longueurs d'onde d'excitation et émission testées pour les chlorophylles c2, c3 et

la phéophytine a.......................................................................................................................20

Tableau 10: Résultats des tests de validation de méthode pour chaque pigment.....................24

Tableau 11: Concentration en chlorophylle a dans chaque lac (µg.L -1 )..................................26 Tableau 12: Concentration en chlorophylle b dosée par HPLC/UV-visible et groupes algaux présents dans chaque lac (µg.L -1 ) évalués par la Fluoroprobe.................................................33

Liste des figures

Figure 1: Structure des chlorophylles a, b, c1, c2 et de la phéophytine a..................................7

Figure 2: Localisation des lacs étudiés.....................................................................................10

Figure 3: Gradients de solvant : en haut, celui testé au début, en bas, celui choisi

définitivement pour les analyses..............................................................................................18

Figure 4: Comparaison des techniques deux à deux de la concentration en chlorophylle a....28 Figure 5: Evolution de la concentration en chlorophylle a pour les trois méthodes analytiques

pour chaque lac en fonction du temps......................................................................................29

Figure 6: Boites à moustache des moyennes en chlorophylle a pour chaque lac et chaque

Figure 7: Boites à moustache des écarts-types pour chaque méthode .....................................30

Figure 8: Evolution du coefficient de variation en fonction des moyennes de concentration en

chlorophylle a pour chaque méthode.......................................................................................31

Figure 9: Chromatogrammes des étalons.................................................................................39

Figure 10: Chromatogrammes d'un échantillon détecté par UV-visible (en jaune) et

fluorimétrie (en rouge).............................................................................................................40

Figure 11: Chromatogramme de la chlorophylle c3 détectée à différentes longueurs d'onde .41

Figure 12: Droite de recouvrement de la chlorophylle c2 en UV-visible et valeurs des

intervalles de confiance du coefficient de la pente a' et de l'ordonnée à l'origine b'..............42

Figure 13: Droites de recouvrement de la chlorophylle b en UV-visible (haut) et fluorimétrie (bas) et valeurs des intervalles de confiance du coefficient de la pente a' et de l'ordonnée à

l'origine b'................................................................................................................................43 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

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Introduction

La chlorophylle est un pigment vert présent chez tous les végétaux et chez certaines

bactéries (cyanobactéries ou algues bleues). On en différencie plusieurs types : chlorophylle

a

, b, c et d. La chlorophylle a se retrouve dans tout le règne végétal contrairement aux autres

chlorophylles qui peuvent être absentes dans certains groupes algaux. Le dosage de ce pigment permet ainsi d'évaluer la quantité de biomasse présente dans les milieux aquatiques

et contribue à la détermination de la composition algale. De plus, les cyanobactéries qui, par

la production de toxines peuvent rendre un milieu toxique, sont détectables dans les eaux grâce aux pigments et chlorophylles qu'elles contiennent. Le dosage de ces pigments peut alors aussi prévenir de la toxicité potentielle d'un milieu. Grâce au développement de méthodes analytiques, les pigments sont quantifiables à des concentrations très faibles (de l'ordre du µg.L -1 ). Ils ont la particularité d'absorber les

rayonnements lumineux, ils peuvent donc être détectés par spectrophotométrie UV-visible. De

plus, ils peuvent être excités par la lumière et émettre des photons donc sont détectables par

fluorimétrie. La première technique mesure directement la concentration en pigment dans l'extrait filtré et la seconde fait des mesures in vivo dans les eaux. Le but du stage est de comparer une sonde fluorimétrique (Fluoroprobe), permettant des mesures in situ des pigments, avec des techniques de référence telles que la spectroscopie

UV-visible et l'HPLC qui nécessitent un échantillonnage puis des étapes de préparation avant

de réaliser le dosage des mêmes pigments. La comparaison des trois techniques est réalisée

avec le dosage de la chlorophylle a dans les eaux de trois lacs : Soustons, Parentis-Biscarosse et Cazaux-Sanguinet. Pour cela, le protocole du dosage de la chlorophylle par HPLC est mis en place, celui des deux autres techniques existant déjà dans le laboratoire de chimie du Cemagref de Bordeaux. Le stage permet de déterminer l'intérêt et les limites de la sonde fluorimétrique mais aussi les avantages et inconvénients de l'HPLC par rapport à la spectroscopie UV-visible pour ce qui est du dosage en laboratoire d'une gamme plus large de pigments. Une première partie présente des généralités concernant les pigments, une seconde

partie détaille les sites d'études, le matériel et les méthodes utilisées pour l'analyse et la

dernière partie exposera les résultats qui débouchent sur une discussion.

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1 Généralités

Les chlorophylles a, b, c1, c2, c3 et d ont des structures similaires comportant un atome de magnésium au centre, seul un groupement latéral change. Les pigments sont très

sensibles à certaines conditions telles que la lumière, la température, l'acidité, la présence

d'oxygène et peuvent se dégrader très rapidement. Ceci entraine la perte de l'atome de magnésium conduisant à la formation de produits de dégradation comme la phéophytine a pour la chlorophylle a. La Figure 1 représente les structures classiques de quelques pigments :

Chlorophylle a Chlorophylle b

Chlorophylle c Phéophytine a

Figure 1: Structure des chlorophylles a, b, c1, c2 et de la phéophytine a CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

8 Grâce aux nombreuses doubles liaisons conjuguées, les pigments absorbent les

photons de la lumière. Ainsi, ils participent à la réalisation de la photosynthèse, réaction

permettant aux végétaux de produire de l"énergie et de la matière organique à partir de la

lumière et d"éléments nutritifs (azote et phosphore). Ils absorbent pour la plupart dans le rouge et le bleu mais les longueurs d"onde varient selon un groupement de substitution qui diffère entre chaque type de chlorophylle. De plus, ils émettent des rayonnements fluorescents dans le rouge s"ils sont excités avec des longueurs d"onde adaptées (dans le bleu). Ceci permet de distinguer les différents pigments et même quelques groupes algaux. En effet, la proportion en chlorophylle varie d"un groupe à l"autre, il peut y avoir un type de chlorophylle présent dans un groupe et absent dans un autre groupe. Les groupes algaux identifiables sont les suivants : Tableau 1: Pigments présents dans les groupes algaux identifiables

Groupe algal Pigments présents

Chlorophycées (algues

vertes) Chlorophylle a et b

Algues brunes Chlorophylle a et c

Diatomées Chlorophylle a, c1 et c2

Cryptophytes Chlorophylle a et c2

Cyanobactéries Chlorophylle a et

phycobilines Les pigments sont détectables et quantifiables par spectroscopies UV-visible et fluorimétrie. Des longueurs d"onde d"absorption maximales sont caractéristiques de chaque

pigment (Tableau 2). Elles peuvent être représentées sur un spectre évaluant l"absorption en

fonction de la longueur d"onde (Ston-Egiert and Kosakowska 2005). Tableau 2: Longueurs d'onde d'absorption dans l'UV-visible pour les pigments quantifiés Pigments Longueurs d"onde d"absorption maximale (nm)

Chlorophylle c3 450 et 590

Chlorophylle c2 450 et 630

Chlorophylle b 460 et 660

Chlorophylle a 435 et 660

Phéophytine a 410 et 650 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref 9 La plupart des pigments présents dans les groupes algaux sont solubles dans les solvants organiques donc peuvent être extraits dans des solvants type méthanol, acétone,

éthanol.

Différentes méthodes analytiques permettent de doser des pigments : la sonde fluorimétrique qui dose in vivo dans les eaux des milieux aquatiques, la spectrophotométrie qui nécessite une filtration, une extraction puis des mesures dans l"extrait directement, la chromatographie liquide à hautes performances couplées à un détecteur UV- visible ou fluorimétrique qui nécessite également une filtration et une extraction avant le dosage les pigments. L"intérêt étant dans ce cas est l"apport de la séparation chromatographique. Le stage permet de comparer les trois techniques d"analyses et de définir les limites et avantages de chacune. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref 10

2 Matériel et méthodes

2.1 Terrain

Les échantillons d'eau ont été prélevés dans trois lacs aquitains: Soustons, Parentis-

Biscarosse et Cazaux-Sanguinet à raison d'une fois par semaine pendant 9 semaines (du

13/05/09 au 07/07/09). La Figure 2 donne leur localisation sur le territoire.

Figure 2: Localisation des lacs étudiés

Le but étant de comparer trois méthodes, trois échantillons ont été analysés pour chaque technique et chaque lac à chacune des dates afin de calculer des moyennes et les écart- types associés. Ces échantillons devaient donc provenir du même milieu avec des conditions expérimentales proches afin d'avoir une concentration homogène en chlorophylle permettant

la comparaison des trois méthodes. Pour ce faire, pour chaque lac, un seau d'eau de 12 L a été

prélevé, conservé à l'ombre et régulièrement mélangé.

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2.2 Tests in situ

Toutes les mesures pouvant être effectuées sur le terrain ont été réalisées directement

dans le seau d"eau.

Les paramètres physico-chimiques :

Ces paramètres sont : le pH, la température, la conductivité de l"eau et le taux

d"oxygène (en % et en mg/l). Ils permettent de contrôler un état stable de l"eau durant toutes

les campagnes. On constate d"après les résultats que le pH ne varie pas beaucoup entre les

lacs mais varie d"une campagne à l"autre contrairement à la conductivité qui est différente

d"un lac à l"autre mais reste constante chaque semaine. Quand au taux d"oxygène, il varie dans un même lac selon la période, les conditions environnementales, etc.

La sonde fluorimétrique ou Fluoroprobe:

La sonde fluorimétrique (Fluoroprobe, bbe Moldaenke, Allemagne) étant transportable et fonctionnant sur le terrain, les mesures de fluorescence de la chlorophylle ont pu être

réalisées in situ. Le protocole d"utilisation de cet appareil a été mis au point l"an dernier

(Becker, A. (2008)). C"est le seul qui permet, pour l"instant, d"obtenir des résultats rapides directement sur le terrain. Cette sonde mesure la fluorescence émise par la chlorophylle. Lorsque celle-ci reçoit un rayonnement d"une longueur d"onde bien définie, elle interagit avec celui-ci du fait de la

présence de doubles liaisons pour passer d"un état stable à un état excité. Elle émet alors un

rayonnement fluorescent de couleur rouge lors de son retour à l"état stable. Les longueurs d"onde d"excitation et d"émission sont différentes selon le type de chlorophylle ce qui permet

de déterminer les groupes algaux présents dans le milieu étudié. En effet, certains pigments

sont caractéristiques de groupes algaux comme la chlorophylle b dans les Chlorophycées ou la chlorophylle c dans les algues brunes. Cependant, ils peuvent se retrouver dans plusieurs

groupes algaux mais en proportions différentes ainsi la réponse détectée par la Fluoroprobe

n"est pas la même selon qu"un groupe algal possède plus un type de pigment qu"un autre. Chaque groupe algal est alors caractérisé par une fluorescence maximale à une longueur d"onde donnée qui diffère selon la densité et la distribution des pigments. Ceci permet de

déterminer les groupes algaux présents dans les eaux étudiées (algues vertes, diatomées,

cryptophytes et cyanobactéries) et d"évaluer la quantité d"algues exprimée en équivalent de

chlorophylle a. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref 12 La sonde mesure la fluorescence de la chlorophylle toutes les 3 secondes. Elle ne fait pas une mesure mais plusieurs mesures dont elle fait la moyenne. Il a été choisi de relever 3 fois 20 mesures afin d"obtenir trois moyennes, comme pour les autres méthodes.

2.3 Tests en laboratoire

Contrairement à la Fluoroprobe, les analyses par spectrophotométrie et HPLC

nécessitent du matériel ne pouvant être transporté sur le terrain, notamment pour l"extraction

et l"analyse. Les prélèvements ont été effectués dans le seau, les filtrations sur place et les

filtres placés pendant la journée dans une glacière à l"obscurité. Ceci permet une meilleure

conservation de la chlorophylle qui se dégrade très vite en présence de lumière, d"oxygène et

de température élevée. Les échantillons sont filtrés sur des filtres GF-F Whatman (diamètre de pore : 0,45 µm) à l"aide d"une pompe manuelle permettant de mieux conserver les pigments. En effet,

une trop forte dépression (causée par des pompes à vide de laboratoire) lors de la filtration

risquerait de détruire les enveloppes cellulaires qui ne retiendraient plus la chlorophylle. Le volume d"eau filtré dépend du nombre de micro-algues et autres organismes présents dans les lacs : Soustons étant très con centré, les volumes étaient d"environ 250 ml et pour Parentis et Sanguinet environ 600 ml. Les filtres sont ensuite conservés dans un congélateur jusqu"à l"extraction et l"analyse.

2.3.1 La spectrophotométrie UV-visible (spectrométrie d'absorption

moléculaire) Une des caractéristiques principales des pigments est leur coloration, due aux nombreuses doubles liaisons présentes. On peut alors les détecter et les doser par mesure de l"absorbance. Comme celle-ci est proportionnelle à la concentration en chlorophylle (loi de

Beer-Lambert), le dosage peut se faire à l"ai

de des intensités des absorbances obtenues en fonction des longueurs d"ondes. La longueur d"onde d"absorption maximale dépend du type de chlorophylle. L"appareil est réglé sur les longueurs d"onde suivantes (en nm): 664 pour la chlorophylle a,

645 pour la chlorophylle

b et 630 pour a chlorophylle c. Une mesure à la longueur d"onde =

750 nm permet d"éliminer les interférences dues à la turbidité (couleur de l"eau).

Le dosage de la chlorophylle par spectrophotométrie se fait selon le protocole définit

par la norme NF T 90-117 : " Dosage de la chlorophylle a et d"un indice phéopigments. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

13 Méthode par spectrométrie d"absorption moléculaire ». L"extraction se fait dans 10 ml

d"acétone aux ultra-sons dans l"obscurité, ce qui permet de lyser les cellules qui libèrent alors

la chlorophylle. L"extrait est filtré sur des filtres GF-F Whatman et récupéré pour être ensuite analysé dans le spectrophotomètre muni d"un double faisceau (PERKIN-ELMER Lambda 2). Le volume de solvant dans lequel les pigments sont dilués est relevé puisqu"il servira au calcul de la concentration en chlorophylle, tout comme le volume d"eau filtrée. Pour chaque échantillon, une mesure de l"absorbance est relevée puis après acidification de celui-ci, une deuxième mesure d"absorbance est effectuée. L"acidification transforme la chlorophylle a en phéophytine a et autres produits de dégradation (phéophorbide a, chlorophyllide a). Mesurer l"absorbance de la solution acidifiée permet d"enlever la part de la biomasse inactive et nécromasse à la concentration totale en chlorophylle (somme de la chlorophylle a et de la phéophytine a) afin d"obtenir la concentration exacte en chlorophylle a et donc en biomasse. Différents calculs permettent d"obtenir les concentrations en chlorophylle a, b et c ((Jeffrey and Humphrey 1975). Les relations utilisées nécessitent de connaitre le volume de solvant, le volume d"eau filtré, le parcours optique du faisceau traversant la cuve et les absorbances.

2.3.2 La chromatographie liquide à haute pression

La chromatographie liquide à haute pression (HPLC) est une méthode d"analyse couramment utilisée pour séparer les constituants d"un mélange selon leurs propriétés physico-chimiques. Pour cela, elle utilise une phase mobile (liquide en HPLC) qui entraîne les composés dans une colonne contenant une phase stationnaire (solide). Les composés sont

entrainés par la phase mobile et sont séparés en fonction des affinités qu"ils ont avec la phase

stationnaire (liaisons H, interactions de Van der Walls, etc.). Il existe différents types de séparations basées sur des phénomènes d"adsorption, de partage, d"échanges d"ions ou

d"exclusion stérique. Pour des molécules de poids moléculaire peu élevé et ayant un caractère

plutôt hydrophobe (comme les pigments), la chromatographie de partage en phase inverse est celle qui correspond le mieux. Elle utilise comme phase stationnaire de la silice greffée C 18 apolaire et comme phase mobile un mélange de solvant allant du plus polaire (méthanol) au moins polaire (acétate d"éthyle). Les pigments recherchés dans les eaux sont les suivants: chlorophylle a, b, c2, c3 et

phéophytine a. Seul le dosage de la chlorophylle a avec cette technique sera comparé avec les CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

14

autres méthodes. Comme ils possèdent tous des groupements différents, ils ne créent pas les

mêmes interactions avec la phase stationnaire et sortent donc de la colonne à des temps

différents selon la phase mobile utilisée. Les pigments sont alors séparés les uns des autres.

Ainsi, l"acidification utilisée pour obtenir la phéophytine a en spectrophotométrie UV-visible

n"est plus nécessaire en HPLC puisque ce pigment est élué à un temps différent de la chlorophylle a (Annexe 1).

Les composés sont ensuite détectés avec un détecteur choisi selon leurs propriétés :

UV-visible ou fluorimétrie si les composés présentent des chromophores leurs permettant d"absorber dans le domaine de l"UV ou du visible (ce qui est le cas des pigments). La

fluorimétrie étant plus spécifique et souvent plus sensible que l"UV-visible, elle permet une

meilleure quantification dans le cas où la molécule émet un rayonnement fluorescent. En

effet, de nombreux composés ont des temps de rétention très proches et les pics sont parfois

mal séparés en UV-visible ce qui peut provoquer une erreur de lectur e ou d"intégration. En

fluorimétrie, ce problème est moins fréquent de fait de la spécificité de la méthode (Annexe

2). Il faut également noter l"utilisation d"une barrette de diodes pour le dosage dans le

domaine du visible, ce type de détecteur autorise l"acquisition de spectres UV-visibles (190-

800 nm) qui permettent d"identifier ou de confirmer la nature des pigments présents dans les

échantillons réels, en plus des temps de rétention. Le protocole pour l"extraction et le dosage de la chlorophylle dans l"eau par HPLC suit

la norme XP T90-116 : " Dosage des chlorophylles a et b par HPLC. Méthode de référence ».

Les échantillons sont filtrés sur filtres GF-F Whatman (diamètre de pore : 0,45 µm) et extraits

dans 5 ml de méthanol absolu aux ultra-sons pendant 20 minutes. Après 10 minutes de repos, ils sont à nouveau filtrés sur filtres GF-F. Toutes ces manipulations doivent s"effectuer à

l"obscurité afin d"éviter la dégradation de la chlorophylle et l"analyse doit s"effectuer le plus

rapidement possible après la filtration et l"extraction. La chaîne HPLC servant aux analyses est équipée des appareils suivants : o Un chromatographe liquide " Finnigan SpectraSYSTEM » o Un dégazeur " SCM1000 », Finnigan SpectraSYSTEM o Une pompe quatre solvants " P4000 », Finnigan SpectraSYSTEM o Un passeur/préparateur/injecteur automatique d"échantillons " AS3000 », Finnigan SpectraSYSTEM CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref 15 o

Une colonne C

18 Spheribond ODS2 (150 x 4 mm, 3 m) munie d'une pré-colonne C 18 (10 x 4 mm, 6 m) (Bischoff Chromatography, Allemagne). o Un détecteur fluorimétrique Jasco FP-1520, Japon o Un ordinateur équipé du logiciel de traitement Chromquest 4.0 (Thermo). Les pigments ayant des polarités et des groupements différents, ils sont élués avec des mélanges de solvants organiques de polarités différentes. Tableau 3: Composition des solvants utilisés en HPLC Solvant A méthanol : 0.5 acétate d'ammonium (80:20, v/v)

Solvant B acétonitrile : eau MQ (90:10, v/v)

Solvant C acétate d'éthyle

Les solvants sont donc introduits du plus polaire (qui élue les composés les plus polaires) au moins polaire (qui élue les composés les moins polaires) en suivant les gradients de concentration suivants :

Tableau 4: Programmation du gradient d'élution

Temps (min) % A % B % C Débit (mL.min -1

0 100 0 0 0,5

1 100 0 0 0,5

12 0 100 0 0,5

18 0 10 90 0,5

20 0 10 90 0,5

22 0 100 0 0,5

29 100 0 0 0,5

34 100 0 0 0,5

Les longueurs d'onde ont été optimisées en UV-visible et fluorimétrie pour tenter d'améliorer la détection (Tableau 5). L'analyse donne un chromatogramme par longueur d'onde utilisée pour la quantification en UV-visible, soit trois chromatogrammes dans ce cas.

En revanche, nous en avons un seul pour la détection par fluorimétrie. En effet, le fluorimètre

permet de programmer les longueurs d'onde d'excitation et émission en fonction des temps de

rétention des composés. Le changement de couples de longueurs d'onde s'effectue donc entre CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

16 deux pigments. De plus le gain et l"atténuati on ont été modifiés pour les quatre derniers pigments car les pics saturaient rapidement.

Tableau 5: Longueurs d'onde utilisées pour la détection des pigments en UV-visible et fluorimétrie

Longueurs d"onde

fluorimétrie (nm)

Pigments Longueurs

d"onde UV- visible (nm)

Excitation Emission Gain/

Atténuation Temps

(min)

Chlorophylle

c3 450 450 600 1000/32 0-9

Chlorophylle

c2 450 440 640 100/128 9-14

Chlorophylle b 450 430 660 100/128 14-22

Chlorophylle a 435 430 660 100/128 14-22

Phéophytine a 410 380 680 100/128 22-34

Les étalons ont été reçus sous forme de poudre (5mg) pour les chlorophylles a et b (Sigma-Aldrich, St-Quentin-Fallavier), qui sont ensuite mis en solution dans le méthanol afin d"obtenir une solution mère de concentration 100 mg.L -1 , ou en solution da ns l"acétone pour les chlorophylles c2 et c3 (c = 1 mg.L -1 ) et la phéophytine a (c = 3,4 mg.L -1 ) (DHI, Danemark). Toutes les solutions d"étalons doivent être préparées dans du méthanol et conservées à l"obscurité, au congélateur. Les concentrations choisies pour la gamme d"étalonnage sont les suivantes : 1 mg.L -1 , 500 µg.L -1 , 250 µg.L -1 , 100 µg.L -1 , 50 µg.L -1 et 10

µg.L

-1 . Un minimum de 5 points permet d"avoir une meilleure précision pour les droitesquotesdbs_dbs29.pdfusesText_35

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