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Quelles sont les etapes de la PCR ?
Chaque cycle de PCR s'effectue en 3 étapes : dénaturation thermique de l'ADN à 95°C, hybridation des amorces à 50-65°C, élongation à 72°C. Les différentes étapes sont réalisées à plusieurs températures dans un appareil appelé thermocycleur.C'est quoi la PCR PDF ?
La PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction de polymérase en chaîne) est une technique d'amplification d'ADN in vitro. Elle permet d'obtenir un très grand nombre de copies d'une séquence d'ADN choisie.Quels sont les deux types de PCR ?
Il existe désormais différents types de PCR comme par exemple la PCR classique, la RT-PCR qui permet de se servir d'ARN comme point de départ en utilisant une transcriptase inverse, la PCR quantitative en temps réel ou qPCR qui permet de mesure la quantité d'ADN polymérisé à chaque cycle (en temps réel) gr? à un- La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication ciblée in vitro. Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie.
23 septembre 2015
Application à la microbiologie des eaux
Protocole de validation
pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) Révision 3 Adoptée par AFNOR Certification le 23/09/2015NF148 -
Protocole de validation PCR Légionelles Révision 3 (Edition du 23-09-2015 Approbation du 23-09-2015)
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SOMMAIRE
........................................................................................................................... 3
Principe.................................................................................................................................................... 3
....................................................................... 51. .... 5
2. ............................................... 5
2.1. .................................................................. 5
2.2. Analyse des résultats .......................................................................................................... 6
3. LD, LQ et seuil de positivité ......................................................................................................10
3.1. Limite de détection de la PCR ........................................................................................... 10
3.2. Limite de quantification de la PCR .................................................................................... 10
3.3. Limite de quantification théorique de la méthode .............................................................. 11
3.4. Seuil de positivité ............................................................................................................... 12
4. Rendement de la méthode, robustesse et incertitude de mesure ........................................12
4.1. .............................................................................................................. 12
4.2. Estimation du rendement ................................................................................................... 14
4.3. Estimation ................................................................................ 16
5. Vérification des calculs et interprétations établis par le logiciel ..........................................16
5.1. Vérification des calculs ...................................................................................................... 16
5.2. Interprétation des inhibitions .............................................................................................. 16
isée par le laboratoire expert) .....................................................................17
1. Inclusivité et exclusivité des sondes et amorces ...................................................................17
1.1. Inclusivité ........................................................................................................................... 17
1.2. Exclusivité .......................................................................................................................... 17
2. Praticabilité .................................................................................................................................18
: étude interlaboratoire ........................................................................................20
1. ....................................................................................20
2. Calendrier prévisionnel .............................................................................................................21
3. Exploitation statistique des données.......................................................................................21
ANNEXE A .............................................................................................................................................22
Annexe A1 ..............................................................................22 Annexe A2 ..........................................................................22Annexe A3 : formulaire de consigne pour la réalisation des essais/fichiers de réponse ........23
NF148 -
Protocole de validation PCR Légionelles Révision 3 (Edition du 23-09-2015 Approbation du 23-09-2015)
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Ce protocole permet de valider une méthode selon les exigences des normes NF T90-471 etISO/TS 12869. Légionelles dans les eaux.
Les méthodes auxquel sont des méthodes commerciales (également appelées " kits » dans la norme NF T90-471). La certification a pour objet de démontrer que les performances de ces méthodes sont conformes à des exigences normatives.La validation d'une méthode commerciale porte simultanément sur le mode opératoire
préconisé par le fabricant, sur les produits d'essais et matériels nécessaires à la mise en
cation précisé.Principe
dans les normes NF T90-471 et ISO/TS 12869, dont les références des paragraphes sont reprises ci-après, avec quelques ajustements et compléments. nt décrites dans le document ci-après. En fonction de la composition de la méthodeSi la méthode à valider est complète, c'est à dire qu'elle comprend la partie préparation de
lon, : Phase 1 : LD, LQ (optionnel pour des kits uniquement dédiés à la détection), fonction de calibrage, raccordement, rendement et robustesse, vérification des calculs des logiciels sur les fonctions quantification et détection Phase 2 : inclusivité/exclusivité, praticabilité/qualité des réactifsPhase 3
artificiellement/naturellement contaminés de validation portera sur les critères suivants : Phase 1 : LD, LQ (optionnel pour des kits uniquement dédiés à la détection), fonction de calibrage, raccordement, vérification des calculs des logiciels sur les fonctions quantification et détection Phase 2 (inchangée) : inclusivité/exclusivité, praticabilité/qualité des réactifsPhase 3
Si la méthode PCR à valider peut être utilisée sur plusieurs thermocycleurs : le fournisseur devra fixer la liste des thermocycleurs du marché qualifiés pour son utilisationQ (optionnel pour des kits
uniquement dédiés à la détection), raccordement et fonction de calibrage (en phase 1 deNF148 -
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caractère majeur ou mineur de la modification. laboratoire expert. Cet avis sera présenté au Bureau Technique. Si des modifications majeures sont apportées à la méthode validée de performance à revalider au minimum :Modification Performances à revalider
Rendement
Robustesse
- hors sondes / amorces -, thermocycleurs) LDLQ (optionnel pour des kits uniquement
dédiés à la détection)Linéarité
Raccordement
Phase de quantification et/ou détection
(modification du système sondes / amorces, thermoprofils) LDLQ (optionnel pour des kits uniquement
dédiés à la détection),Linéarité
Raccordement
Inclusivité, exclusivité
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1. Raccordement de la solution calibrante et du matériau de
Suivre les instructions décrites dans le chapitre 11.2 de la norme NF T90-471.Le raccordement sera réalisé sur un lot.
2. Etude de la fonction de calibrage
quantitative 2.1. (Cf. § 10.3.3 de la norme NF T90-471) ience suivant doit être réalisé dans des conditions de reproductibilité intermédiaire. Préparer une gamme de p niveaux. p est le nombre préconisé par le fournisseur, au moinségal à 4, au plus à 6, par exemple, à 25, 250, 2 500, 25 000 unités génome de Legionella
pneumophila par tube réactionnel. La gamme est préparée à partirLegionella pneumophila WDCM 00107.
Le premier point de la gamme doit être égal à la limite de quantification (voir § 10.4 de la norme
NF T90-471). A chaque niveau, faire la mesure sur un nombre total de k gammes, k étant au moins égal à 5.Enregistrer les valeurs
jiy, tableau 3 de la norme, repris ci-après.Calculer le nombre total de mesures noté
N pkNNF148 -
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Tableau 1 (NF T90-471) Mise en forme des résultats et calculsNiveau xi
PCRLQx1
PCRLQx102
PCRLQx1003
PCRLQx10004
pxSommes
iixx10log' 1'x 2'x 3'x 4'x px' jiy, (k répétitions) y1,1 y2,1 y3,1 y4,1 yp,1 y1,2 y2,2 y3,2 y4,2 yp,2 y1,k y2,k y3,k y4,k yp,k k j jiiyT 1T1 T2 T3 T4 Tp
p i iGTT 1 k Tmi i m1 m2 m3 m4 mp iiTx 11'Tx 22'Tx33'Tx
44'Tx
ppTx' i p i iTx 1' Où ix Legionella pneumophila par tube réactionnel (les valeurs des niveaux ix sont ix' est le logarithme décimal de ix jiy, est la valeur de CT mesurée au niveau i i varie de 1 à p ) et de rang j j varie de 1 à k k est le nombre de répétitions par niveau i k 5) p est le nombre de niveaux et est supérieur ou égal à 4 Voir en Annexe C de la norme un exemple complet des calculs.
2.2. Analyse des résultats
Estimation de la droite de régression (Cf. § 10.3.4.1 de la norme)La droite de régr2) :
baxCTymoyen ' Tracer sur un graphique les points de coordonnées (1, m1 p, mp) pour vérifier aux calculs suivants : p i pixxxxxkx 1 4 3 2 1...' (3) p i pixxxxxkx 1 2'2' 4 2' 3 2' 2 2' 1 2...' (4)NF148 -
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Procéder aux calculs suivants en vue de déterminer la pente a :Variance de xi =
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