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UNIVERSITE JOSEPH FOURIER - GRENOBLE 1
SCIENCES-TECHNOLOGIE-SANTE
Année 2006 N°
THESE pour obtenir le grade deDOCTEUR DE L'UNIVERSITE JOSEPH FOURIER
Discipline : Biologie Cellulaire
présentée et soutenue publiquement le 3 novembre 2006 parBlandine GARAIT
Le stress oxydant induit par voie métabolique (régimes alimentaires) ou par voie gazeuse (hyperoxie) et effet de la GliSODinDirecteur de thèse : Dr. Roland FAVIER
JURYDocteur Béatrice MORIO Rapporteur
Professeur Michel RIGOULET Rapporteur
Professeur Anne-Marie ROUSSEL Examinateur
Monsieur Bernard MONTANARI Examinateur
Professeur Xavier LEVERVE Président
Docteur Roland FAVIER Directeur
Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée - EMI0221 1SOMMAIRE
Abreviations ...............................................................................................................................3
II. Le Stress oxydant....................................................................................................................8
I.1. Différentes formes de radicaux libres de l'oxygène (ros).................................................8
I.2. Principale source de radicaux libres : la mitochondrie ....................................................9
I.2.1. Chaîne respiratoire mitochondriale.........................................................................11
I.2.2. Rendement de l'oxydation phosphorylante .............................................................13
I.2.3. Production de ROS..................................................................................................16
I.3. Systèmes Anti-oxydants.................................................................................................20
I.3.1. Systèmes antioxydants enzymatiques.....................................................................21
I.3.2. Systèmes antioxydants non enzymatiques..............................................................23
I.4. Dégâts cellulaires...........................................................................................................25
I.4.1. Peroxydation lipidique............................................................................................25
I.4.2. Oxydation des proteines..........................................................................................25
I.4.3. Dommage de l'ADN...............................................................................................26
I.4.4. Activation du pore de transition de perméabilité....................................................27
II. Les régimes alimentaires .....................................................................................................29
II.1. Restriction calorique et rat Lou/C.................................................................................29
II.1.1. Restriction calorique..............................................................................................29
II.1.2. Le rat Lou/C...........................................................................................................34
II.2. Régime riche en lipides.................................................................................................36
II.3. Régime riche en saccharose / fructose..........................................................................42
III. L'Hyperoxie........................................................................................................................46
III.1. Hyperoxie sevère (O
2 > 90%)......................................................................................47III.2. Preconditionnement hyperoxique................................................................................50
IV. Supplémentation en antioxydants et GliSODinIV.1. Supplémentation en antioxydants................................................................................52
IV.2. GliSODin
V. Orientation du travail...........................................................................................................57
MATERIEL & METHODES........................................................................................................58
I. Animaux................................................................................................................................59
I.1. Etude I............................................................................................................................59
I.2. Etude II...........................................................................................................................60
I.3. Etude III .........................................................................................................................61
II. Dépense énergétique et activité locomotrice.......................................................................61
III. Préparations des mitochondries isolées..............................................................................62
III.1. Homogénats de muscle squelettique............................................................................62
III.2. Homogénats de foie.....................................................................................................63
III.3. Isolement des mitochondries.......................................................................................63
IV. Respiration mitochondriale................................................................................................64
V. Production mitochondriale d'H
2 O 22V.1. Mesure avec la sonde acide homovanillique (étude 1).................................................66
V.2. Mesure avec la sonde amplex red reagent (étude 2 et 3)..............................................67
VI. Potentiel de membrane mitochondrial................................................................................67
VII. Capacité de rétention calcique..........................................................................................68
VIII. Activités enzymatiques sur mitochondries isolées..........................................................70
VIII.1. Citrate synthase.........................................................................................................70
VIII.2. Complexe I (NADH-ubiquinone oxidoreductase roténone-sensible).......................70VIII.3. Complexe II (succinate-ubiquinone reductase)........................................................71
VIII.4. Complexe IV (Cytochrome c oxydase)....................................................................71
IX. Cytochromes de la chaine respiratoire...............................................................................72
X. Paramètres du stress oxydant...............................................................................................72
X.1. Préparation des homogénats.........................................................................................72
X.2. Péroxydation lipidique (mesure des TBARS)..............................................................73
X.3. Oxydation des protéines (mesure des thiols)................................................................73
X.4. Glutathion.....................................................................................................................73
X.5. Superoxyde dismutase (SOD) ......................................................................................74
X.6. Glutathion peroxydase (GPx).......................................................................................74
X.7. Catalase.........................................................................................................................75
XI. Concentration d'ARN d'UCP2 et UCP3 dans le muscle...................................................75
XII. Composition en lipides et en acides gras des membranes mitochondriales......................76XII.1. Composition en phospholipides.................................................................................77
XII.2. Composition en acides gras .......................................................................................77
XIII. Statistiques.......................................................................................................................78
RESULTATS & DISCUSSION......................................................................................................79
Etude I ......................................................................................................................................80
Etude II.....................................................................................................................................96
Etude III..................................................................................................................................118
CONCLUSION GENERALE.......................................................................................................136
B A 3ABREVIATIONS
ǻȥ potentiel de membrane
pH différence de pH de part et d'autre de la membrane mitochondrialeµ force protomotrice
AA antimycine A
ADN acide désoxyribonucléique
ADP adénosine-5'-diphosphate
AGE dernier produit de la glycation des protéines (Advanced Glycation End)AGMI acide gras monoinsaturé
AGPI acide gras polyinsaturé
AGS acide gras saturé
ANT transporteur des nucléotides adényliquesARA acide gras arachidonique
ATP adénosine-5'-triphosphate
ATPase F
0 -F 1ATP synthase
BSA albumine de sérum bovin
Ca 2+ ion calciumCOX cytochrome c oxydase
CRC capacité de rétention calcique
Cu/Zn-SOD superoxyde dismutase aux ions cuivre et zincCYP enzyme cytochrome P450
DAG diacylglycérol
DNP 2,4-dinitrophénol
FADH 2 /FAD flavine adénine dinucléotide réduite/oxydée FCCP p-trifluorométhoxycarbonylcyanide phénylhydrazoneFMN flavine mononucléotide
GAPDH glycéraldehyde phosphate déshydrogénaseG6PDH glucose-6-phosphate déshydrogénase
GPx glutathion peroxydase
GR glutathion reductase
GSH/GSSG glutathion réduit/oxydé
4HCl chlorure d'hydrogène
HSP protéine de stress (Heat Shock Protein)
H 2 O 2 peroxyde d'hydrogèneJATP flux de synthèse d'ATP
JO 2 flux de consommation d'oxygèneLC-CoA acyl-CoA à chaîne longue
Mn-SOD superoxyde dismutase associée au manganèseNADH,H
/NAD nicotinamide adénine dinucléotide réduit/oxydéNADPH,H
/NADP nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit/oxydé O 2 dioxygène O 2- anion superoxyde OH ion hydroxyde OH radical hydroxylePKC Protéine Kinase C
Q quinone
TBARS acide thiobarbiturique
Pi phosphate inorganique
PTP pore de transition de perméabilité
RCR rapport de contrôle respiratoire
ROS espèces réactives oxygénées (Reactive Oxygen Species)SOD superoxyde dismutase
TMPD N,N,N',N' tétraméthyl-1,4-phenylènediamineUb ubiquinone
UbH ubisemiquinone UbH 2 ubiquinol UCP protéine découplante (UnCoupling Protein) w3 acide gras polyinsaturé omega 3 w6 acide gras polyinsaturé omega 6 5AVANT-PROPOS
Une espèce réactive de l'oxygène (Reactive Oxygen Species : ROS) est un radical oxygéné (O 2- , OH ) ou une molécule pouvant produire des radicaux libres (H 2 O 2 ). Cesespèces chimiques très instables et très réactives sont produites d'une manière continue au
sein de notre organisme dans le cadre de nombreux phénomènes biologiques. En condition dite "physiologique", la production de ROS reste faible et ne concerne qu'un faiblepourcentage de l'oxygène capté par la respiration. Elle est alors indispensable à l'organisme en
participant à divers processus vitaux tels que : la transduction de signaux cellulaires, larégulation des gènes et le fonctionnement de certaines enzymes, la défense immunitaire contre
les agents pathogènes et la destruction par apoptose de certaines cellules tumorales. Cependant, cette production de ROS peut être amplifiée de façon excessive par différents mécanismes physio-pathologiques (inflammation, activité sportive...) ou facteurs environnementaux (tabac, alcool, médicament, rayons gamma ou ultra-violets...) créant un déséquilibre de la balance prooxydant/antioxydant : c'est le stress oxydant. La cellule necontrôle alors plus cet excès de ROS qui va engendrer de nombreux dégâts cellulaires ; une
situation que l'on retrouve dans le processus de vieillissement (théorie radicalaire du vieillissement) et dans la plupart des pathologies humaines (Alzheimer, diabète, cancer, cataracte, parkinson, psoriasis, sida). Ainsi, ayant besoin d'une certaine quantité de ROS, l'organisme ne cherche pas à éliminer mais à contrôler leur niveau pour éviter ce stress oxydant. Les ROS sont principalement générés au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale. Parmi les différents paramètres modulant leur production, la nature deséquivalents réduits (NADH,H
et FADH 2 ) et l'apport en oxygène sont essentiels. Ceséquivalents réduits sont fournis par les divers nutriments que nous ingérons, la composition
des régimes alimentaires peut donc avoir une répercussion sur la production de ROS. Les concentrations en oxygène inspirées sont, elles, modifiées par des conditions environnementales comme l'altitude (hypoxie) ou lors de traitement pour certaines pathologies respiratoires (hyperoxie).6 Au vu de ces données, nous avons décidé de nous intéresser aux effets de différents
régimes alimentaires (restriction calorique, régimes riches en lipides ou en fructose) ainsi qu'à
l'hyperoxie sur la production mitochondriale de ROS. De plus, le stress oxydant pouvant être minimisé par des apports en antioxydants, nous avons également étudié les conséquences d'une supplémentation par la GliSODin qui est principalement constitué de superoxyde dismutase (la SOD ; une enzyme antioxydante). 7 INTRODUCTION
Introduction - Stress Oxydant
8I. LE STRESS OXYDANT
I.1. DIFFERENTES FORMES DE RADICAUX LIBRES DE L'OXYGENE (ROS) Un radical libre est une espèce chimique, atome ou molécule, contenant un électronnon apparié. Extrêmement instable, ce composé peut réagir avec les molécules les plus stables
pour apparier son électron. Il peut soit arracher un électron (se comportant comme un oxydant), soit en céder un (agissant alors comme un réducteur). Cette première réactionconduit généralement à la formation en chaîne de nouveaux radicaux ; ceci explique que la
production d'un premier radical libre puisse causer d'importantes lésions dans une cellule. L'O 2 est une molécule biradicalaire formée de deux atomes présentant sur leur orbitale externedeux électrons non appariés. Il est donc susceptible de capter facilement 1 puis 2 électrons
pour être partiellement réduit en O2•-
puis en H 2 O 2 . Il est ainsi à l'origine de la formation d'espèces réactives oxygénées (Reactive Oxygen Species : ROS) L'appellation ROS inclut les radicaux libres de l'oxygène : anion superoxyde (O2•-
radical hydroxyle (OH ) mais aussi certains dérivés oxygénés non radicalaires dont la toxicité est importante tels que le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 Figure 1 : Schéma des différentes formes de ROS O 2 H 2 O 2 O2•-
peroxyde d'hydrogèneanion superoxyde radical hydroxyleActivation des cascades
des kinasesOxydation des
protéinesPeroxydation
lipidiqueOxydation de
l'ADN OH réaction d'Haber-Weiss réaction de Fenton O 2 H 2 O 2 O2•-
peroxyde d'hydrogèneanion superoxyde radical hydroxyleActivation des cascades
des kinasesOxydation des
protéinesPeroxydation
lipidiqueOxydation de
l'ADN OH réaction d'Haber-Weiss réaction de FentonIntroduction - Stress Oxydant
9L'anion superoxyde (O
2- ) est un radical chargé négativement provenant de laréduction monovalente de l'oxygène moléculaire qui capte un électron. La dismutation de cet
O 2- entraîne la formation d'oxygène fondamental et de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ). L'H 2 O 2n'est pas un radical libre au sens propre mais il est extrêmement réactif et possède un fort
pouvoir oxydant. De plus, sa capacité à traverser les membranes biologiques fait qu'il peut se retrouver à une grande distance de son lieu de production.Selon la réaction de Fenton, l'H
2 O 2 se décompose, en présence d'ions ferreux (Fe 2+ ), en un ion OH et un radical hydroxyle (OH ) [H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ ]. Cette réaction s'interrompt rapidement par épuisement du fer ferreux, excepté en présence d'anion superoxyde (O 2- ) qui régénère Fe 3+ en Fe 2+ selon la réaction d'Haber-Weiss [O 2- + Fe 3+ O 2 + Fe 2+ ]. Ainsi, la présence simultanée de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ), d'anion superoxyde (O 2- et de fer permet la production de radical hydroxyle (OH L'OH , avec une demi-vie de l'ordre de la nanoseconde, est la plus instable et la plus réactivede toutes les espèces dérivées de l'oxygène. La diffusion limitée de ce radical lui permet de
réagir avec de nombreuses espèces moléculaires se trouvant à proximité (protéines, lipides,
ADN...) entraînant ainsi de multiples dommages cellulaires. L'OH apparaît comme l'espèce radicalaire ayant un rôle majeur dans la cytotoxicité des ROS (Gutteridge & Halliwell, 1993). I.2. PRINCIPALE SOURCE DE RADICAUX LIBRES : LA MITOCHONDRIEquotesdbs_dbs20.pdfusesText_26[PDF] I.2.8. Le rhumatisme articulaire aigu - France
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