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Date : 27/03/2012 Page : 1/ 11 Introduction aux techniques de luminescence et label-free VIII - Mesure de la libération de calcium intracellulaire L'objet de ce chapitre est de présenter le principe du Fluo-4 AM, une sonde calcique de synthèse principalement utilisée sur la plateforme ARPEGE pour mesurer la libération calcique intracellulaire dépendante de l'activation des protéines hétérotrimériques de type Gq. Impliqué dans de nombreux processus physiologiques (libération de neurotransmetteurs, contraction musculaire, coagulation sanguine, ossification...) et dans la signalisation intracellulaire où il agit comme second messager, le calcium est un élément essentiel à la vie, ce qui explique sa très fine régulation au sein de l'organisme (homéostasie calcique) et donc l'importance de son étude. Historiquement, la première sonde fluorescente chimérique1 sensible aux oscillations calciques intracellulaires a été développée par Miyawaki et ses collaborateurs2. Depuis, de nombreux efforts ont été réalisés dans le développement de sondes toujours plus sensibles. Les sondes principalement utilisées pour étudier la dynamique de la signalisation calcique intracellulaire sont des protéines fluorescentes modifiées comme l'aequorine3 et le GCaMP64, ou des molécules synthétiques comme le Fura-2 ou le Fluo-4. Ces sondes ont été utilisées avec succès dans différentes applications comme la fluorimétrie en microplaques ou encore la microscopie. Une des premières sondes synthétiques utilisée en microscopie de fluorescence pour le suivi dans le temps de la libération intracellulaire du calcium fut le Fura-2 développé par le groupe de Roger Tsien5. Plus tard, ce même groupe développa des versions améliorées de cette sonde dont le Fluo-36 et son analogue optimisé, le Fluo-47. 1 Protéine artificielle obtenue par la combinaison de différentes protéines. 2 Miyawaki A, et al., Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin, Nature (1997). 3 Contrairement aux sondes classiques l'aequorine émet spontanément des photons en présence de Ca2+. Il n'est donc pas nécessaire de l'exciter avec une source lumineuse. De plus, de par sa nature protéique, la sonde est directement produite par les cellules ce qui permet d'éviter les étapes de chargement des cellules avec la sonde comme pour les fluorophores organiques. 4 Chen TW et al., Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity, Nature (2013). 5 Grynkiewicz G, et al., A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties, JBC (1985). 6 Minta A, et al., Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores, JBC (1989). 7 Gee KR, et al., Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+ indicator dyes, Cell calcium (2000).

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Structure du Fluo-4 : Le Fluo-4 est constitué de deux parties : - le fluophore (fluorescein-like), - le chélateur spécifique de l'ion calcium Ca2+ (BAPTA8-like). Les caractéristiques du Fluo-4 sont résumées dans le tableau ci-dessous : Fluo4 λmax (exc.) (ion-bound) 494 nm λmax (em.) (ion-bound) 516 nm Kd (Ca2+) 345 nM εmax 88 000 cm-1M-1 ε488 nm 77 000 cm-1M-1 QY 0,14 λmax (exc.) et λmax (em.) : longueurs d'ondes maximales d'excitation et d'émission en présence de calcium, Kd (Ca2+) : constante de dissociation9 pour le calcium, εmax : coefficient d'extinction molaire au maximum d'absorption, ε488nm : coefficient d'extinction molaire à 488 nm (longueur d'onde généralement utilisée pour l'excitation de ce type de molécule), QY : rendement quantique. (afin de mieux comprendre ces caractéristiques, voir le chapitre sur le transfert d'énergie10) Lorsque la sonde est excitée avec une source lumineuse centrée sur son pic d'absorption, autours de 488 nm, l'émission de photons par le fluorophore sera principalement dépendante de la présence de calcium dans le milieu (Figure 59). 8 Le BAPTA est un acide aminopolycarboxylique capable de former un complexe avec le calcium. 9 Le Kd ou constante de dissociation (unité en Molaire, M) reflète ici l'affinité du chélateur calcique pour l'ion calcium. Lorsque le calcium intracellulaire est à une concentration correspondant au Kd, on considère que la moitié des sondes calciques présentes ont liées un ion calcium. 10 http://www.arpege.cnrs.fr/IMG/pdf/Principe_techniques_RET.pdf

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Figure 59. Spectre d'émission du Fluo-4 dans une solution contenant de 0 à 39,8 µM de calcium libre (test in vitro). Afin de rendre le Fluo-4 perméant, c'est-à-dire capable de traverser la membrane plasmique des cellules, un groupement acétoxyméthylester (AM) a été ajouté au Fluo-4 pour former le Fluo-4 AM (Figure 60). Ce groupement masque les charges négatives des groupements carboxyles (R-COOH) de la sonde ce qui la rend hydrophobe (lipophile). Sous cette forme, le Fluo-4 AM est capable de traverser la membrane des cellules mais l'ajout de ce groupement le rend insensible au calcium (empêche la complexation11 de l'ion par le chélateur). Figure 60. Structure du Fluo-4 AM. 11 Désigne la capacité de groupements fonctionnels (-COOH...) à former des complexes avec des cations comme ici le calcium.

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C'est une fois dans le cytoplasme que des estérases endogènes12 clivent par hydrolyse le groupement AM du Fluo-4 AM, libérant ainsi la forme carboxylée active de la sonde (-COOH) : le Fluo-4 (Figure 61). A B Figure 61. A) Entrée du Fluo-4 AM dans la cellule et mesure de la libération calcique intracellulaire. B) Clivage des groupements AM par les estérases endogènes. Sous cette forme, la sonde devient sensible aux ions calcium qu'elle peut alors lier (Figure 62A). Le Fluo-4 lie le calcium avec un Kd de 345 nM qui se situe dans la gamme des niveaux de calcium intracellulaire de la plupart des lignées cellulaires13 (Figure 62B). Cette liaison se traduit par une augmentation de l'intensité de fluorescence du Fluo-4. Il est ainsi possible de suivre des cinétiques rapides de variation de la concentration intracellulaire en calcium en mesurant en temps réel l'intensité de la fluorescence du Fluo-4. 12 Enzymes intracellulaires capables de cliver des groupements ester R-COO-R'. 13 A l'extérieur de la cellule, le calcium est à une concentration relativement élevée (>1 mM) dont un tiers environ est lié à des protéines (albumine). La concentration en calcium est également élevée dans différents compartiments cellulaires comme le réticulum endoplasmique. Au niveau du cytoplasme, au contraire, la concentration du Ca2+ est faible (100 nM), mais elle peut s'élever rapidement (> 1 µM) sous l'effet d'un stimulus extracellulaire.

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A B Figure 62. A) Liaison d'un ion calcium par le Fluo-4. B) Concentrations cellulaires en calcium. La valeur en noir correspond à l'état de repos et en rouge lors d'une stimulation. MECANISME PHYSICO-CHIMIQUE DE LA VARIATION D'INTENSITE DE FLUORESCENCE DU FLUO-4 EN PRESENCE OU EN ABSENCE DE CALCIUM : La complexation de l'ion calcium au niveau de la sonde entraîne une modification de l'environnement électronique et un changement de propriété de fluorescence du Fluo-4. Ceci est dû à la structure chimique du Fluo-4 qui forme un système donneur-accepteur d'électrons. Le chélateur correspond au donneur d'électron lorsque celui-ci n'est pas complexé à un ion calcium et le fluorophore joue le rôle d'accepteur d'électron (Figure 63).

Date : 27/03/2012 Page : 6/ 11 Introduction aux techniques de luminescence et label-free Lorsque l'on excite la sonde par une source lumineuse, le fluorophore passe, au niveau électronique, d'un état fondamental à un état excité. Dès lors, deux phénomènes principaux peuvent intervenir (Figure 63) : - la fluorescence (voir cours d'introduction sur la fluorescence14), - le transfert d'électron photo-induit (Photoinduced Electron Transfer, PET)15 • En absence d'ion calcium : La désexcitation du fluorophore s'effectue par un processus d'oxydo-réduction16 impliquant un transfert d'électron photo-induit. Cela signifie qu'au sein du Fluo-4, le chélateur va jouer le rôle de donneur d'électron (réducteur) et le fluorophore excité le rôle d'accepteur d'électron (oxydant). Cette voie de désexcitation est non radiative (sans émission de lumière) et le rendement de fluorescence du fluorophore est donc quasiment nul. • En présence d'ion calcium : La chélation du calcium modifie les propriétés électroniques du chélateur ce qui ne favorise plus le transfert d'électron photo-induit. La désexcitation du fluorophore s'effectue donc par le retour de l'électron de l'état excité vers son état fondamental avec émission d'un photon. C'est le phénomène de fluorescence. Dans le cas du Fluo-4, on parle donc de " système off-on ». 14 http://www.arpege.cnrs.fr/IMG/pdf/Principe_techniques_RET.pdf 15 Prasanna de Silva A et al., Fluorescent PET (Photoinduced Electron Transfer) sensors as potent analytical tools, Analyst (2009). 16 Une réaction d'oxydoréduction est une réaction chimique au cours de laquelle se produit un échange d'électron entre le réducteur qui cède un électron à l'oxydant qui le capte.

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Figure 63. Transfert d'électrons au sein du Fluo-4. A) En l'absence de calcium et après excitation du fluorophore par une source lumineuse (1), le chélateur se comporte comme un donneur d'électron (2) empêchant le retour de l'électron du fluorophore17 vers son état fondamental18. Ce dernier se désexcite et prend la place de l'électron perdu par le chélateur (3). B) La liaison du calcium en modifiant les propriétés électroniques du chélateur favorise le retour de l'électron vers son état fondamental avec émission d'un photon de fluorescence (2). UTILISATION DU FLUO-4 ET CELLULES VIVANTES Différentes étapes sont nécessaires avant toute mesure du signal calcique en cellules vivantes. • Chargement des cellules avec la sonde : Il est nécessaire de charger dans un premier temps les cellules avec le Fluo-4 AM19. La solution de charge contient généralement un inhibiteur de transporteurs 17 Ici les électrons du niveau fondamental sont représentés par des flèches antiparallèles qui représentent le spin des électrons soit, de manière approximative, l'état de rotation des deux électrons. 18 L'état fondamental est aussi appelé HOMO pour Highest Occupied Molecular Orbital. L'état excité est aussi appelé LUMO pour Lowest Unoccupied Molecular Orbital. 19 Incubation des cellules pendant 1h en présence de 1 µM de Fluo-4 AM en général afin de charger le cytoplasme des cellules avec le Fluo-4 AM.

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signal de base (bruit de fond) anioniques (OAT pour Organic Anion Transporters) : le probénicide. En effet, certaines cellules comme les HEK293 présentent à leur surface des OAT qui expulsent hors de la cellule le Fluo-4. • Lavage des cellules : Les sondes encore présentes dans le milieu extracellulaire sont éliminées par lavages. • Stimulation de protéines membranaires induisant une libération intracellulaire de calcium : Le Fluo-4 est classiquement utilisé pour des tests de criblage dont le but est de caractériser les effets pharmacologiques de petites molécules extracellulaires agissant sur des protéines transmembranaires comme les Récepteurs Couplés aux Protéines G ou RCPG (Figure 64). Figure 64. Cinétique de la libération intracellulaire du calcium (cellule HEK293) induite par l'activation d'un RCPG stimulé par des doses croissantes d'agoniste. L'activation de ce récepteur par une molécule agoniste induit, au travers de l'activation de son premier effecteur (la protéine Gq), une libération de calcium intracellulaire.

Date : 27/03/2012 Page : 9/ 11 Introduction aux techniques de luminescence et label-free Comme on peut le noter sur le graphique de la Figure 64, un signal de base est mesurable (après stimulation lumineuse) bien que les cellules ne soient pas encore stimulées par l'agoniste. Il est important de rappeler que les cellules ont en moyenne une concentration cytoplasmique de calcium libre de 100 nM (voir plus haut). Par conséquent, le simple chargement des cellules avec la sonde permet de détecter ce niveau de base en calcium intracellulaire. Le signal mesuré avant la stimulation des cellules correspond au bruit de fond et il dépend principalement du nombre de cellules présentes dans les puits au moment de la mesure ainsi que de l'efficacité d'incorporation de la sonde20. L'activation du récepteur par l'agoniste induit, au travers de l'activation de son premier effecteur (la protéine Gq), une libération de calcium intracellulaire. Cette libération de calcium est généralement transitoire avec un pic qui est atteint au bout de quelques secondes. Le signal décroit ensuite rapidement du fait d'une part de la rapide recapture du calcium libre au niveau d'organites comme le réticulum endoplasmique (ATPases) ou de la mitochondrie (échangeur Na+/Ca2+) et d'autre part de son expulsion à l'extérieur de la cellule par des pompes membranaires (ATPase). Il est important de rappeler que la complexation du calcium par le Fluo-4 est réversible, c'est-à-dire que le calcium fixé au Fluo-4 peut repasser à l'état libre. • Appareil de mesure (fluorimètre) : Les mesures du flux calciques sont réalisées sur un lecteur de type Flexstation® (Molecular Devices). Ce lecteur semi-robotisé permet de réaliser des mesures dynamiques de la libération de calcium intracellulaire (Figure 65). 20 Généralement pour les HEK293, 70-100 000 cellules sont ensemencées par puits d'une plaque 96 puits.

Date : 27/03/2012 Page : 10/ 11 Introduction aux techniques de luminescence et label-free Figure 65. Lecteur de plaque Flexstation® 3. Le signal de base est mesuré dans les puits de la plaque contenant les cellules. Après un temps défini, les composés sont injectés dans les puits contenant les cellules et l'évolution du signal de fluorescence est mesurée en temps réel pendant un temps donné. • Analyse des résultats : Différentes méthodes d'analyse peuvent être utilisées pour exploiter les signaux calciques (aire sous la courbe, signal maximum - minimum...). Nous retiendrons ici l'analyse en variation du signal de fluorescence : ΔFluorescence = FMax - FMin avec FMax qui correspond à l'intensité du signal de fluorescence à son pic et FMin à l'intensité du signal de fluorescence avant stimulation par l'agoniste. Ce mode de calcul permet de représenter l'amplitude du signal pour une condition donnée. Ce mode de calcul permet de s'affranchir des différences de signal basal. Dans l'exemple de la Figure 66, le récepteur métabotropique du glutamate mGluR5 a été activé par son agoniste naturel le glutamate. Ce récepteur étant couplé aux protéines Gq, son activation induit entre autre, une libération de calcium intracellulaire qui peut être suivie en temps réel avec la sonde Fluo-4.

plaque contenant les cellules plaque contenant les composés à injecter pointes utilisés pour injecter les composés Date : 27/03/2012 Page : 11/ 11 Introduction aux techniques de luminescence et label-free

Figure 66. Activation du récepteur mGluR5 exprimé dans des cellules HEK293 par du glutamate. Après ajout de glutamate sur les cellules HEK293, la fluorescence du Fluo-4 varie au cours du temps. Le première phase, augmentation du signal de fluorescence, correspond à la libération de calcium intracellulaire transitoire induite par l'activation du récepteur mGluR5. Après une dizaine de secondes, le pic calcique (FMAX) est atteint et le signal de fluorescence revient rapidement à son niveau basal (FMIN) (≈ 1 minute) du fait de la recapture/expulsion du calcium intracellulaire par la cellule. Conclusion Le choix de la sonde calcique dépend essentiellement de l'origine du signal calcique que l'on souhaite mesurer. Comme nous l'avons mentionné précédemment, le Fluo-4 est une sonde parfaitement adaptée à la mesure de la dynamique des oscillations calciques cytoplasmiques. Cependant, d'autres sondes seront mieux adaptées à des mesures locales de la concentration calciques dans des organites particuliers comme le réticulum endoplasmique ou la mitochondrie21. 21 Paredes RM et al., Chemical calcium indicators, Methods (2008).

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