[PDF] Caractérisation et classification des phases stationnaires utilisées

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THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS VI

Chimie Analytique

Katell LE MAPIHAN

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS VI

" CARACTERISATION ET CLASSIFICATION

DES PHASES STATIONNAIRES UTILISEES

POUR L'ANALYSE CPL DE PRODUITS

PHARMACEUTIQUES »

Remerciements

Tout d'abord, je tiens à remercier sincèrement mon directeur de thèse, Monsieur Alain JARDY, ainsi que mon co-encadrant de thèse, Monsieur Jérôme VIAL, tous deux Maîtres de

Conférences à l'ESPCI. L'encadrement dont ils m'ont fait bénéficier allie idéalement expertise et

rigueur scientifiques à une grande ouverture d'esprit et une curiosité insatiable. Le tout associé à

des qualités humaines rares, la dynamique qui s'en dégage m'a permis de surmonter les diverses

difficultés de cette thèse. Aussi, je les remercie encore de la confiance qu'ils m'ont accordée et de

la liberté qu'il m'ont laissée pour mener à bien ces travaux. Ce travail a été réalisé dans le Laboratoire Environnement et Chimie Analytique de

l'Ecole Supérieure de Physique et de Chimie Industrielles de la Ville de Paris, dirigé par Madame

le Professeur Marie-Claire HENNION. Qu'elle trouve ici mes remerciements pour m'avoir

accueillie au sein de son laboratoire et fait découvrir la grande richesse des sciences séparatives.

Ces travaux n'auraient sans conteste pas pu voir le jour sans leur initiation et leur financement par Sanofi-Aventis, représenté par Monsieur Laurent DUHAU, Directeur des

Sciences Analytiques, qui a suivi régulièrement l'avancée de cette étude, et qui me fait le plaisir de

participer à ce jury. Je tiens en outre à remercier particulièrement Messieurs Pascal ANGER et

Jean-Michel MENET de leur intérêt et du soutien qu'ils m'ont apporté pour permettre l'aboutissement de ces travaux et leur application en milieu industriel. Messieurs David Victor McCALLEY, Reader in Separation Science à la Faculté des Sciences Appliquées de l'Université d'Angleterre Occidentale, et Jacques CROMMEN, Professeur au Laboratoire d'Analyse des Médicaments de l'Université de Liège, m'ont fait le grand honneur de juger ce travail et d'en être rapporteurs. Je leur en suis extrêmement reconnaissante. Je tiens encore à exprimer ma gratitude envers Messieurs Pierre GAREIL, Professeur à

l'Université Pierre et Marie Curie et à l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Paris, Pierre

LANTERI, Professeur au Laboratoire des Sciences Analytiques de l'Université Claude Bernard de Lyon ainsi que Monsieur Franck STEINER, Docteur au Laboratoire d'Analyse et de

Bioanalyse Instrumentales de l'Université de

Sarre, qui ont bien voulu donner de leur temps

précieux pour juger ce travail. Ces travaux n'auraient certainement pas pu être aussi approfondis sans le soutien efficace

des fabricants et des distributeurs de phases stationnaires : qu'ils soient ici encore remerciés pour

leur collaboration. Je remercie tout particulièrement Claude COLIN pour m'avoir initiée à la chimie des solvants non aqueux, Mélanie COHEN et Patrick SASSIAT, pour leur grande disponibilité et leur aide sans faille. Sont associés aussi à ces remerciements tous les membres du Laboratoire

Environnement et Chimie Analytique de l'ESPCI, Didier, José, Patrice, Pierre, Emilie, Gwenaëlle,

Florence, Laure, Christophe, Dominique, Gabriel, Kiwi, Hélène, Jean-Marc, Frédéric et tous les

autres... Un grand merci aussi à Delphine PFLIEGER, pour son soutien actif, son assistance technique, sa curiosité et ses conseils avisés. Sans oublier Hélène LOMBOIS et Alexandra

ROOS, sans lesquelles jamais je n'aurai fait la connaissance d'Igor, ce qui eut été dommageable

pour ces travaux... Je tiens aussi à remercier Gilles, Amélie, Catherine et Aurélien, élèves de 3ème année à

l'ESPCI et qui ont contribué à une meilleure compréhension de ces travaux, ainsi que Sébastien

et Chrystelle, relecteurs assidus de ce manuscrit pour en débusquer la plupart des coquilles. Enfin, je tiens à remercier ma famille pour son soutien permanent et la patience infinie

dont elle a fait preuve pour m'aider à supporter tous les aléas de cette période, sans oublier les

encouragements réguliers de mes amis proches. i

SOMMAIRE

Résumé ___________________________________________________________________ v Liste des publications_______________________________________________________vii Introduction _______________________________________________________________1 Partie A : Synthèse bibliographique et problématique ______________________________3 Chapitre I Les phases stationnaires greffées apol

aires et l'analyse de solutés basiques 5 I.A Introduction ____________________________________________________________ 5

I.B La matrice de silice ______________________________________________________ 5 I.B.1 Propriétés générales ___________________________________________________________ 5

I.B.2 Méthode de synthèse de la silice : le sol-gel ________________________________________ 10

I.C Les silices greffé

es apolaires ______________________________________________ 13 I.C.1 Méthodes de greffage _________________________________________________________ 13 I.C.2 Propriétés du support greffé ____________________________________________________ 19

I.D De l'origine de la diversité des phases : réduction de l'accès aux silanols résiduels et

extension de la gamme de polarité________________________________________________ 21 I.D.1 Introduction_________________________________________________________________ 21 I.D.2 Stratégies d'élimination des silanols______________________________________________ 21 I.D.3 Stratégies de masquage des silanols ______________________________________________ 23 I.D.4 Combinaisons _______________________________________________________________ 27 I.E Conclusion ____________________________________________________________ 27

Chapitre II Pourquoi une classification fondée sur une caractérisation ciblée ? _____29 II.A Introduction ___________________________________________________________ 29

II.B Les tests spectroscopiques________________________________________________ 31 II.C Les tests chromatographiques ____________________________________________ 32 II.C.1 Tests basés sur des modèles ____________________________________________________ 32

II.C.2 Tests descriptifs______________________________________________________________ 33 II.D Conclusion ____________________________________________________________ 42

Chapitre III L'apport de la chimiométrie à la classification des colonnes III.A Analyse de corrélation___________________________________________________ 44 III.A.1 Principe__________________________________________________________________ 44 III.A.2 Applications ______________________________________________________________ 45

III.A.3

Limitations _______________________________________________________________ 47 III.B Analyse en Composantes Principales_______________________________________ 48 III.B.1 Principe__________________________________________________________________ 48 III.B.2 Applications ______________________________________________________________ 48 III.B.3 Limitations _______________________________________________________________ 49 III.C Analyse en Clusters _____________________________________________________ 50 III.C.1 Principe__________________________________________________________________ 50 III.C.2 Applications ______________________________________________________________ 51 III.C.3 Limitations _______________________________________________________________ 52 III.D Couplages ACP-AHC ___________________________________________________ 52 III.E Conclusion ____________________________________________________________ 53 ii Partie B : Développement du test______________________________________________55 Chapitre IV Méthanol et acétonitrile : deux modificateurs non interchangeables _____59 IV.A Introduction ___________________________________________________________ 59 IV.B Effet sur la force isoéluante_______________________________________________ 59 IV.B.1 Principe de l'étude et choix des solutés _________________________________________ 60 IV.B.2 Conditions expérimentales ___________________________________________________ 60 IV.B.3 Résultats et discussion ______________________________________________________ 61 IV.C Effet sur les phases stationnaires __________________________________________ 63 IV.C.1 Conditions expérimentales ___________________________________________________ 63 IV.C.2 Résultats_________________________________________________________________ 64 IV.D Conclusion ____________________________________________________________ 75 Chapitre V Construction du test : d'un test étendu à un test réduit pertinent ________77 V.A Introduction et principe _________________________________________________ 77 V.B Partie expérimentale ____________________________________________________ 77 V.B.1 Appareillage ________________________________________________________________ 77 V.B.2 Jeu de solutés________________________________________________________________ 77 V.B.3 Conditions chromatographiques _________________________________________________ 79 V.B.4 Colonnes testées _____________________________________________________________ 80 V.C Traitement des données__________________________________________________ 81 V.C.1 Prétraitement/Organisation des données___________________________________________ 81 V.C.2 Outils chimiométriques utilisés__________________________________________________ 82 V.D Résultats et discussion ___________________________________________________ 82 V.D.1 Test dans les conditions étendues______________________________________________ 82 V.D.2 Réduction du test __________________________________________________________ 86 V.D.3 Test final_________________________________________________________________ 93 V.E Conclusion ____________________________________________________________ 94 Chapitre VI Pouvoir discriminant du test : étude de la variabilité interlot ___________97 VI.A Introduction ___________________________________________________________ 97 VI.B Partie expérimentale ____________________________________________________ 99 VI.B.1 Instrumentation____________________________________________________________ 99 VI.B.2 Conditions chromatographiques_______________________________________________ 99 VI.B.3 Phases stationnaires _______________________________________________________ 100 VI.C Traitement des données_________________________________________________ 100 VI.C.1 Modèle _________________________________________________________________ 100 VI.C.2 Principe de l'exploitation ___________________________________________________ 100 VI.D Résultats et discussion __________________________________________________ 101 VI.D.1 Résultats sur les colonnes SymmetryShield RP18 ________________________________ 101 VI.D.2 Résultats sur les colonnes XTerra RP18________________________________________ 103 VI.D.3 Comparaison des dispersions interlot__________________________________________ 104 VI.E Conclusion ___________________________________________________________ 107 Chapitre VII Etude de robustesse : domaine d'application _____________________109 VII.A Introduction ________________________________________________________ 109 VII.B Plan d'expériences utilisé _____________________________________________ 109 VII.B.1 Identification des facteurs et des réponses ______________________________________ 109 VII.B.2 Sélection du modèle _______________________________________________________ 110 VII.B.3 Plan d'expérimentation_____________________________________________________ 110 VII.C Réalisation expérimentale_____________________________________________ 112 VII.C.1 Réalisation des essais ______________________________________________________ 112 VII.C.2 Protocole opératoire de chaque essai __________________________________________ 112 iii VII.D Principe de l'exploitation _____________________________________________ 112 VII.D.1 Elimination des réponses peu informatives _____________________________________ 112 VII.D.2 Calcul des effets et interprétation statistique ____________________________________ 113 VII.D.3 Construction du domaine robuste_____________________________________________ 113 VII.E Résultats et discussion________________________________________________ 116 VII.E.1 Indice d'information et sélection des réponses___________________________________ 116

VII.E.2 Estimation des coefficients du modèle et interprétation____________________________ 116

VII.E.3 Détermination du domaine de robustesse_______________________________________ 122 VII.F Conclusion _________________________________________________________ 126 Partie C : Applications_____________________________________________________129 Chapitre VIII Extension de la base de données _______________________________131 VIII.A Introduction ________________________________________________________ 131 VIII.B Conditions expérimentales ____________________________________________ 131 VIII.B.1 Instrumentation___________________________________________________________ 131 VIII.B.2 Conditions chromatographiques______________________________________________ 131 VIII.B.3 Colonnes testées__________________________________________________________ 131

VIII.C Préliminaires à l'exploitation : étude de la rétentivité moyenne des solutés ____ 133

VIII.D Résultats et discussion________________________________________________ 134 VIII.D.1 Principe_________________________________________________________________ 134 VIII.D.2 Interprétation physico-chimique des classifications obtenues par Analyse en Composantes

Principales 134

VIII.D.3 Etude des classifications et illustrations chromatographiques _______________________ 151 VIII.E Conclusion _________________________________________________________ 164 Chapitre IX Construction des cartes d'identité : aide au choix raisonné des colonnes IX.A Introduction __________________________________________________________ 165 IX.B Sélection des descripteurs _______________________________________________ 165 IX.B.1 Choix des descripteurs potentiels_____________________________________________ 165 IX.B.2 Etudes de corrélations______________________________________________________ 165 IX.B.3 Rapport informativité/robustesse _____________________________________________ 170 IX.C Caractérisation des supports_____________________________________________ 171 IX.C.1 Visualisation des cartes d'identité sous forme de diagrammes radars _________________ 171 IX.C.2 Colonnes de même phase stationnaire _________________________________________ 173 IX.C.3 Colonnes de phases stationnaires différentes ____________________________________ 176 IX.D Du choix raisonné des colonnes chromatographiques ________________________ 183 IX.D.1 Principe_________________________________________________________________ 183 IX.D.2 Définition des phases protégées ______________________________________________ 183 IX.E Conclusion ___________________________________________________________ 184 Conclusion générale_______________________________________________________185 Références bibliographiques ________________________________________________187 Listes des abréviations _____________________________________________________209 Liste des tableaux_________________________________________________________211 Liste des tableaux_________________________________________________________211 iListe des figures __________________________________________________________213 Annexe 1 Rappel sur les interactions________________________________________219 Annexe 2 Mélanges hydroorganiques et composés ionisables ____________________221 Annexe 3 Caractéristiques des composés_____________________________________225 Annexe 4 Instrumentation ________________________________________________231 Annexe 5 Préparation des tampons et des phases mobiles _______________________233 Annexe 6 Protocole du test________________________________________________235 Annexe 7 Caractéristiques des colonnes testées _______________________________241 Annexe 8 Effet chromatographique de la contamination support par des impuretés métalliques 243 Annexe 9 Etude interlot __________________________________________________245 Annexe 10 Comparaison régression PLS/régression MLR______________________257 Annexe 11 Extension de la base de données : ACP interprétées _________________259

Résumé

Lors du développement d'une nouvelle méthode de séparation, choisir la colonne CPL appropriée parmi les plus de 600 disponibles commercialement constitue un challenge d'autant

plus difficile à relever que le mélange à séparer implique des produits basiques, rendant nécessaire

le besoin d'une caractérisation et d'une classification des phases stationnaires. Pour ce faire, la

seule approche simple et valide repose sur un test chromatographique effectué systématiquement

sur toutes les phases stationnaires d'intérêt. La littérature propose de nombreux tests dédiés à la

caractérisation des phases stationnaires. Cependant, aucun d'entre eux n'apparaît comme satisfaisant pour caractériser in extenso les phases, notamment les plus récentes, du fait de conditions trop restreintes en termes de solvants et de solutés sondes, dont les propriétés physico-chimiques ne recouvrent que trop partiellement celles des composés à séparer. Partant de ce constat, nous avons développé notre propre procédure de test, avec une

approche radicalement différente : au lieu de choisir des solutés et des conditions a priori dont on

postule finalement le pouvoir de caractérisation, nous les avons sélectionnés en maximisant leur

variété sans pour autant négliger des aspects pratiques de mise en place. Nous avons aussi démontré en premier lieu que ce n'est pas tant la colonne en soi qu'il est intéressant de

caractériser, mais plutôt le couple colonne/solvant. D'un point de vue méthodologique, notre

procédure a d'abord été réalisée dans conditions étendues afin de maximiser le potentiel de

caractérisation. La combinaison d'un raisonnement chromatographique avec les outils de l'analyse

multivariée nous a permis de réduire considérablement la procédure initiale de test sans perte

significative d'information. Ainsi, le test réduit comporte au final 15 solutés, un seul niveau de pH

fixé à 5 et deux niveaux de fraction pour chaque modificateur organique, en l'occurrence le méthanol et l'acétonitrile.

Une fois les conditions du test sélectionnées, nous nous sommes ensuite intéressé à la

validation de notre méthodologie, point souvent éludé dans la littérature. Nous avons donc

réalisé une étude de robustesse de notre test grâce à la méthode des plans d'expériences. Associé

à une étude portant sur l'interlot de phases stationnaires, le plan D-optimal mis en place a permis

non seulement de définir le domaine de robustesse du test, de façon à ce que tout utilisateur

sache précisément les tolérances applicables aux facteurs lors de la mise en place du test, mais

aussi d'éclaircir les mécanismes gouvernant la rétention grâce au modèle du second degré utilisé.

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