[PDF] Origine et développement des cellules germinales chez lhuître

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UNIVERSITE DE BRETAGNE OCCIDENTALE - BREST Ecole Doctorale des Sciences de la Mer THESE pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE BRETAGNE OCCIDENTALE

Discipline : Océanologie Biologique

Présentée et soutenue publiquement par

Caroline FABIOUX

le 10 septembre 2004 Origine et développement des cellules germinales chez l'huître Crassostrea gigas : Intérêt pour le contrôle de la reproduction en écloserie JU RY : M. Marcel LE PENNEC Professeur, Université de Bretagne Occidentale Directeur de thèse

M. Alexis FOSTIER

Directeur de recherche, INRA Rennes Rapporteur

M. Pascal FAVREL Professeur, Université de Caen Rapporteur Mme Liliane NONNOTTE Professeur, Université de Bretagne Occidentale Président du j ury M. Philippe GOULLETQUER Chargé de recherche, Ifremer Examinateur M. Jean-Claude COCHARD Chargé de recherche, Ifremer Examinateur

UNIVERSITE DE BRETAGNE OCCIDENTALE - BREST

Ecole Doctorale des Sciences de la Mer

THESE pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE BRETAGNE OCCIDENTALE

Discipline : Océanologie Biologique

Présentée et soutenue publiquement par

Caroline FABIOUX

le 10 septembre 2004 Origine et développement des cellules germinales chez l'huître Crassostrea gigas : Intérêt pour le contrôle de la reproduction en écloserie

JURY :

M. Marcel LE PENNEC Professeur, Université de Bretagne Occidentale Directeur de thèse M. Alexis FOSTIER Directeur de recherche, INRA Rennes Rapporteur M. Pascal FAVREL Professeur, Université de Caen Rapporteur Mme Liliane NONNOTTE Professeur, Université de Bretagne Occidentale Président du jury M. Philippe GOULLETQUER Chargé de recherche, Ifremer Examinateur M. Jean-Claude COCHARD Chargé de recherche, Ifremer Examinateur

Remerciements

Je tiens à exprimer mes remerciements à toutes les personnes qui ont participé, à titre professionnel ou personnel, à la réalisation de cette thèse. Le Professeur Marcel Le Pennec a assuré la direction de cette thèse et m'a soutenue dans mes démarches, tant scientifiques que pédagogiques, tout au long de ces quatre années ; je le remercie très sincèrement. J'exprime toute ma gratitude au Professeur Alexis Fostier et au Professeur Pascal Favrel qui m'ont fait l'honneur d'être rapporteurs de ma thèse. Je tiens également à remercier chaleureusement le Professeur Liliane Nonnotte d'avoir présidé le jury ainsi que Philippe Goulletquer, Marcel Le Pennec et Jean-Claude Cochard pour leur participation à ce jury. Ce travail de thèse a été réalisé au sein de deux laboratoires associés : le Laboratoire des Sciences de l'Environnement Marin (LEMAR) de l'Université de Bretagne Occidentale et le Laboratoire de Physiologie des Invertébrés (LPI) du centre Ifremer de Brest, ce dernier formant depuis 2003 l'UMR Physiologie et Ecophysiologie des Mollusques Marins avec le Laboratoire de Biologie et Biotechnologies Marines de l'Université de Caen. Je suis reconnaissante aux directeurs respectifs de ces laboratoires, le Professeur Jacques Clavier puis Laurent Memery du LEMAR, Jean- Claude Cochard puis Jean-Louis Nicolas du LPI, ainsi qu'au Professeur Michel Mathieu directeur de l'UMR PE2M, qui m'ont accueillie dans leurs équipes de recherche et m'ont donné les moyens matériels et financiers de réaliser ce travail. Merci également à Jean-Claude Cochard d'avoir encadré mes premiers pas de thésarde mais aussi pour ce tour de France des laboratoires Ifremer qui fut fort instructif tant au niveau professionnel que culturel. Je tiens à remercier tout particulièrement un binôme d'encadrement de choc : Arnaud Huvet et Stéphane Pouvreau. Tous deux m'ont soutenue tout au long de ma thèse, ils m'ont donné d'innombrables conseils, m'ont guidée dans l'orientation de mes

travaux et m'ont aidée à valoriser mes résultats. Merci à toi Nono de m'avoir enseigné

tout ce que tu savais (ou presque...) en bio. mol., pour ton aide au cours de toutes ces longues journées de prélèvements, pour ton soutien dans la rédaction de mes premières publications et pour avoir passé autant de temps et d'énergie à la correction de ce manuscrit. Merci Steph de t'être démené lors de la mise en route de la station expérimentale d'Argenton afin que "tes thésardes" puissent commencer leurs expérimentations au plus tôt, de m'avoir enseigné les rouages de l'histologie, de l'analyse d'images et de la reproduction des bivalves, pour ton aide dans la rédaction des publications et pour la gestion de la partie "relations humaines". Merci à vous deux pour votre énergie, votre passion, votre motivation et votre joie de vivre, ce fut un vrai bonheur de travailler avec vous. Je vous dois beaucoup. Merci à Jean-Yves pour ses conseils, sa disponibilité permanente et sa grande rigueur dans le domaine de la biologie moléculaire. Merci à Jean-François, Jeanne et René pour leurs conseils, leur soutien ainsi que pour la relecture des publications et la correction des communications qu'ils ont assurées en supplément de leur travail. J'exprime mes sincères remerciements à toute l'équipe de la station expérimentale d'Argenton pour la gestion de la partie expérimentale de ma thèse, les conditionnements de géniteurs, les croisements expérimentaux et les élevages larvaires.

Merci à Christian, Pierrick et Stéphane qui ont pris soin de "mes" huîtres. Merci à René

et à Christian d'avoir donné naissance à tant de petites larves. Merci à Jean-Paul et à

Bertrand pour la création et l'entretien de cette jungle miniature de microalgues qui sert à nourrir quotidiennement tout ce petit monde à deux valves. Merci à vous tous pour votre bonne humeur permanente, pour ces déjeuners animés dans la petite cuisine d'Argenton et pour ces barbecues parfois pluvieux autour du vivier. Au cours de ma thèse, j'ai été accueillie dans différents laboratoires où je me suis formée à de nouvelles techniques, notamment au Laboratoire de Génétique et Pathologie (LGP) de l'Ifremer de La Tremblade et au Laboratoire de Biologie et Biotechnologies Marines de l'Université de Caen. Merci à Frédérique Le Roux du LGP de m'avoir initiée à l'hybridation in situ, pour ses conseils avisés, son dynamisme et son accueil. Merci à Christophe Lelong de sa collaboration lors des premiers pas de l'hybridation in toto chez C. gigas. Merci également à Tristan Renault du LGP et à Philippe Soudant du LEMAR de m'avoir formée en cytométrie en flux, de s'être investis dans ce projet aux résultats alors incertains et pour la relecture de la publication. Je suis reconnaissante au Professeur Liliane Nonnotte qui m'a guidée dans mes premiers pas d'enseignante pendant mes trois années de monitorat à l'Université de Brest et m'a soutenue pour l'obtention d'un poste d'ATER à mi-temps, ce qui m'a permis de terminer sereinement ma thèse. Merci également à Valérie Stiger, Emmanuelle Plée-Gautier et Stella Roy pour leur aide, leurs conseils et leur accompagnement dans mon apprentissage de l'enseignement, en particulier durant ces fameux TP de biochimie. Enfin, je tiens à remercier l'ensemble des personnes du LPI pour ces quatre années passées ensemble, ainsi que les autres thésards du labo : Maryse, Yannick et Hélène pour tout ce que nous avons partagé et surtout bon courage à vous pour la fin de cette grande aventure qu'est la thèse... J'ai débuté la recherche dans le monde peu connu des huîtres lors de mon stage de DEA à la station Ifremer de La Tremblade. Je remercie Pierre Boudry de m'avoir permis d'entrer dans cet univers scientifique, d'avoir assuré la direction de ce stage et de m'avoir fourni de précieux conseils. Et parce que la vie ne serait pas aussi belle sans eux, je remercie tous mes amis : Merci à Aude, Phil, Fab et Damien que j'ai rencontrés au cours du DEA "Océano Bio" et qui, comme moi, sont passionnés par le monde sous-marin. Merci pour tous les

moments mémorables passés ensemble à Banyuls, à Roscoff ou ailleurs... en plongée, à la

plage, en soirées ou en week-ends. Bonne chance à vous tous pour la suite et à très bientôt au bord d'un des océans du globe ! Merci à mes amis d'ailleurs, si loins et si proches à la fois. Merci Vinie pour ta grande amitié et bonne chance à toi pour ta nouvelle aventure Norvégienne... à très bientôt à Bergen. Muchas gracias Alma, para tu amistad desde hace mas de 10 años, en España, Allemaña y Francia. Merci à toi Pat, québécois iroquois-normand, pour ta

présence de l'autre côté de l'Atlantique et j'espère à bientôt sous un autre océan.

Merci à Arnaud, Maryse, Yannick, Maud et Julien pour tous les moments sportifs ou festifs que nous avons partagés... pour les sorties roller (à quand les prochaines 24H du Mans ?), pour les sessions morey à la pal., pour les midis piscine (et sauna !) et après l'effort... pour tous ces petits restos de Brest que nous avons testés. Merci à Steph et

Vali pour ces p'tites soirées, toujours bien difficiles à planifier. Merci à Leila... profite

bien de ta nouvelle vie de maman et d'enseignante, chez toi, en Tunisie. Merci Maeva pour ta gentillesse et pour ton accueil toujours très chaleureux lors de mes séjours à La Tremblade. Merci à Mirella pour ce mois franco-brésilien très sympa "in english" ou "en español" et j'espère à bientôt à Brest. Ma curiosité pour l'univers marin s'est éveillée alors que je marchais à peine, au cours de mes explorations des mares bretonnes, à Perros, où j'ai découvert tout un petit monde aquatique dont les figures emblématiques étaient les "bébés crabes", les crevettes, les bigorneaux et les gobies. Quelques années plus tard, j'ai découvert la plongée sous-marine dans les eaux bleu azur de la Corse. C'est là que j'ai compris que ce monde sous-marin, qui me passionnait depuis longtemps déjà, ferait désormais partie de ma vie... A mes parents à qui je dois cet amour de la mer et qui m'ont toujours soutenue dans tous mes projets,

A Yoann, mon super p'tit frère.

Table des matières

Premier chapitre : Introduction 5

1. La reproduction........................................................................

1.1 Les deux grands modes de reproduction........................................................................

................7

1.2 Les cellules germinales, base de la reproduction........................................................................

...9

1.3 La gamétogenèse........................................................................

2. Le gène vasa, déterminant et marqueur de la lignée germinale...........................22

2.1 Introduction........................................................................

2.2 La famille protéique des DEAD-box........................................................................

...................23

2.3 Le gène vasa dans le règne animal........................................................................

......................24

2.4 Rôle de vasa dans la formation des cellules germinales..............................................................26

2.5 Rôle de vasa au cours de la gamétogenèse........................................................................

..........34

2.6 Quelques fonctions particulières de vasa........................................................................

.............36

2.7 Applications pratiques de vasa........................................................................

............................37

3. Modèle biologique, l'huître creuse Crassostrea gigas...........................................38

3.1 L'ostréiculture, histoire et enjeux actuels........................................................................

.............38

3.2 Données biologiques........................................................................

3.3 Reproduction et développement........................................................................

..........................43

3.4 Maîtrise de la reproduction en écloserie........................................................................

..............50

4. Problématique de l'étude........................................................................

......................52

Second chapitre : Matériel et méthodes 55

1. Recherche d'un gène candidat........................................................................

.............57

1.1 Construction d'amorces dégénérées........................................................................

.....................57

1.2 Extraction et quantification des ARN totaux........................................................................

.......58

1.3 Transcription inverse........................................................................

1.4 Amplification par PCR........................................................................

1.5 Purification des produits d'amplification, clonage et séquençage................................................61

1.6 Analyse de séquence........................................................................

1.7 Extension de l'ADNc par RACE-PCR........................................................................

.................63

2. Etude du développement des cellules germinales des huîtres adultes..............65

2.1 Matériel biologique et plan d'expérience........................................................................

.............65

2.2 Analyse du cycle de reproduction........................................................................

........................71

2.3 Etude du profil d'expression du gène candidat........................................................................

....73

2.4 Etude du cycle cellulaire des cellules germinales........................................................................

81

2.5 Analyses statistiques........................................................................

3. Etude du développement des cellules germinales de C. gigas au cours de

3.1 Matériel biologique........................................................................

3.2 Extraction des ARN totaux........................................................................

..................................87

3.3 Etude du profil d'expression du gène candidat au cours du développement embryonnaire.........88

3.4 Analyses statistiques........................................................................

Troisième chapitre : Origine et développement des cellules germinales de

Crassostrea gigas 91

1. Oyvlg, premier marqueur de la lignée germinale de C. gigas.................................92

2. Formation de la lignée germinale de C. gigas au cours de l'ontogenèse............99

3. Etude du cycle cellulaire des cellules germinales mâles......................................106

Quatrième chapitre : Régulation du cycle de reproduction de Crassostrea gigas par les paramètres température/photopériode 121

1. Température et photopériode gouvernent la dynamique du cycle de

reproduction de C. gigas........................................................................ ..........................122

2. Influence des paramètres température / photopériode sur l'expression du

gène Oyvlg........................................................................

2.1 Introduction........................................................................

2.2 Résultats........................................................................

2.3 Discussion........................................................................

Cinquième chapitre : Discussion générale, Conclusion et perspectives 159

1. Discussion générale........................................................................

...............................160

1.1 Le gène Oyvlg, hélicase de l'ARN et "RNA binding-protein"...................................................160

1.2 Origine et développement de la lignée germinale de C. gigas...................................................161

1.3 Régulation du développement de la lignée germinale...............................................................169

1.4 Applications pour la reproduction contrôlée de C. gigas en écloserie.......................................173

2. Conclusion et perspectives........................................................................

.................175

Bibliographie 179

Liste des figures et tableau 195

Liste des abréviations 198

Premier chapitre :

Introduction

5

Premier chapitre : Introduction

Métazoaires

Spongiaires

Eumétazoaires

Cnidaires

Cténophores

Bilatériens

Echinodermes, Urochordés, Céphalochordés,

Vertébrés : Poissons, Amphibiens,

Mammifères, Oiseaux, Reptiles, Chéloniens

Protostomiens

Deutérostomiens

Lophotrochozoaires

Ecdysozoaires

Onychophores, Tardigrades,

Arthropodes, Nématodes,

Kinorhynches, Locifères

Rotifères

Entoproctes

Plathelminthes

Némertes

Siponcles

Annélides

Brachiopodes

Phoronidiens

Epongescalcaires, Démosponges,

Epongesexactinellides

Mollusques

Métazoaires

Spongiaires

Eumétazoaires

Cnidaires

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