[PDF] Guide Corning pour lidentification et la résolution des problèmes

Guide Corning pour l'identification et la résolution des problèmes communs de croissance cellulaire 1ère Partie Bulletin technique John Ryan A., Ph.D. Corning Incorporated Life Sciences 900 Lowell Saint-Chelmsford, MA 01851 Table des matières Intoduction .............................................................. 1 Processus de traitement des surfaces .................... 2 Problèmes liés au protocole .................................... 2 Introduction Bien que très populaire parmi les chercheurs en sciences de la vie, la culture cellulaire peut être une technique très difficile à maitriser au laboratoire. Contrairement à d'autres outils courants au laboratoire comme l'électrophorèse ou la chromatographie, la culture cellulaire utilise des organismes vivants. Ces cellules vivantes répondent à nos erreurs, non seulement par un comportement erratique commun à d'autres techniques de laboratoire, mais en mourant totalement, ce qui peut entrainer la disparition de l'outil lui-même. En tant que l'un des principaux fournisseurs de consommables de culture cellulaire, Corning Life Sciences reçoit souvent des appels de clients inquiets qui ont des problèmes de croissance ou d'adhésion avec leurs lignées cellulaires. Habituellement, le client, qui recherche une cause (et une solution) à son problème, soupçonne un changement ou une erreur dans le processus de fabrication des consommables qu'il utilise, ou suppose que le traitement de la surface réalisé sur la plupart des récipients de culture cellulaire n'a pas été correctement fait. Les fabricants de milieux de culture et de sérums reçoivent également des appels similaires de clients qui recherchent à juste titre le responsable de la perte de leurs cellules ou de leur comportement erratique. En raison de la nature complexe de la culture cellulaire, l'identification des causes sous-jacentes aux problèmes de comportement de la culture est souvent une tâche difficile et consommatrice de temps. Le comportement erratique de la culture peut prendre plusieurs formes; les profils de croissance inhabituels ou incohérents, inégaux, ou une adhésion cellulaire non reproductible sont les problèmes les plus couramment observés. Les changements brusques ou progressifs de la vitesse de croissance ou encore l'obtention de résultats expérimentaux incohérents sont également observés à l'occasion. En culture cellulaire, tout changement soudain est suspect et source de problème potentiel et, par conséquent, doit être évité. Corning Life Sciences a aidé à de nombreuses reprises les clients à gérer ces problèmes. En utilisant certaines des informations acquises lors de ces contacts avec les clients, Corning a réalisé ce guide pour vous aider à identifier les causes plus ou moins fréquentes de vos problèmes de culture afin de les résoudre. L'accent sera mis sur trois sources de problèmes courants: le protocole technique, l'incubateur et les milieux. En plus des renseignements fournis dans ce guide, il est fortement recommandé de vous référer aux articles énumérés dans les

2 références ou sur le site web Corning Life Science (www.corning.com/lifesciences) pour des recommandations supplémentaires. Processus de traitement des surfaces La première des choses suspectées dans le cas de problème de culture cellulaire est généralement le support ou le flacon de culture utilisé. Les problèmes liés au milieu de culture seront traités dans un chapitre ultérieur. Une grande partie de la suspicion qui pèse sur les consommables plastiques pour la culture cellulaire est due au manque de compréhension des processus de traitement spéciaux utilisés pour modifier la surface. La résine de polystyrène brute utilisée pour la fabrication de la plupart des récipients de culture cellulaire est hydrophobe dans son état initial. Les facteurs protéiques d'attachement ne se lient pas bien à cette surface naturelle ce qui limite l'adhésion cellulaire et la croissance. Pour cette raison, soit une décharge électrique (corona discharge) ou un traitement par plasma est utilisé dans des conditions soigneusement contrôlées pendant le processus de fabrication pour insérer des atomes d'oxygène (sous la forme de groupes carboxyle) dans le squelette de la chaîne carbonée du polystyrène (Ramsey et al, 1984; Amstein et Hartman , 1975; Hudis, 1974). Cette modification du polymère plastique (qui n'est pas une altération de surface réversible du revêtement), permet d'obtenir une surface hydrophile avec une charge nette négative qui créé un support approprié pour la fixation et la croissance des cellules. Les récipients de culture sont ensuite stérilisés et rigoureusement évalués par des tests de contrôle qualité pour s'assurer qu'ils ont reçu le degré approprié de traitement. Etant donné que cette surface modifiée n'est pas différente à l'oeil de la surface non traitée, il n'y a pas de moyen facile pour les utilisateurs de vérifier l'adéquation des processus de traitement. En conséquence, de nombreux clients pensent que les problèmes d'adhésion cellulaire et de croissance sont causés par des erreurs de fabrication du support. Il est donc très important de déterminer l'incidence du support plastique sur la cause du problème détecté aussi rapidement que possible afin de se concentrer sur la cause réelle. Habituellement, la première étape consiste à comparer les performances du support suspecté contre le même produit à partir d'un lot de production différent, ou contre des flacons similaires d'un autre fabricant. Si une différence est prouvée, il faut alors contacter le fabricant du produit. Si le support de culture est mis hors de cause, l'utilisateur peut alors continuer ses investigations pour rechercher la solution. Les exemples suivants vous aideront à identifier certains problèmes communs régulièrement associés à tort aux consommables. Problèmes liés au protocole Les problèmes de culture cellulaire les plus courants sont dus aux activités quotidiennes d'entretien des cultures. La perte de la culture due à une contamination représente le problème le plus fréquent et le plus grave. Toutefois, de nombreux autres problèmes, moins graves et pas aussi évidents qu'une contamination, peuvent affecter les cultures et les expérimentations. Souvent, le premier signe est détecté lors d'une observation des cellules au microscope en parallèle d'un profil de croissance inhabituel. Identifier le ou les causes à la source du problème est souvent l'étape la plus difficile, pour ensuite mettre en place la bonne solution. Parfois, des problèmes de croissance transitoires sont observés puis disparaissent sans que la cause ne soit jamais identifiée. Il faut cependant noter que beaucoup de ces problèmes de croissance ne sont pas faciles à détecter lors de l'observation microscopique de routine des cultures vivantes. Les observations sur les échantillons d'abord fixés (glutaraldehyde 2,5% ou éthanol 70%) puis colorés (1% de colorant cristal violet) sont plus sensibles lorsqu'il s'agit d'identifier un problème.

3 Problèmes de croissance en flacons, boîtes et plaques Spots Des zones claires, qui peuvent ressembler à des plages de lyse virale isolées ou en grappe, apparaissent sur les bords ou au centre des supports de culture (Figure 1). Figure 1 Ceci est généralement provoqué par la présence de mousse ou de bulles dans l'inoculum initial. Bien qu'elles semblent flotter en surface, les bulles provoquent en profondeur le déplacement des cellules qui ne peuvent pas adhérer au support : si la base de la bulle est en contact avec le fond du flacon, les cellules peuvent se fixer sur cette partie de la surface de culture. Même des bulles qui se forment transitoirement peuvent avoir cet effet. Les bulles qui se forment pendant la réalimentation des cultures, lorsque les cellules sont déjà attachées, peut limiter le contact du milieu frais avec les cellules. Cela se traduira par une nécrose des cellules dans ces zones si les bulles restent assez longtemps. La formation de bulles peut généralement être évitée par une manipulation minutieuse lors du mélange et du pipetage. Croissance non uniforme Un mélange inadapté de l'inoculum de cellules dans le milieu, en particulier si le support est une boîte de culture, peut entraîner une distribution, un attachement et une croissance non uniformes des cellules (Figure 2). Il suffit d'appliquer un moyen efficace de mélange sans créer de bulles ou de mousse. Fugure 2

4 Une croissance non uniforme peut également être provoquée par les forces de cisaillement générées par le déversement du milieu frais sur les cellules en monocouches au moment de la réalimentation en milieu ou lors des déplacements des flacons entre la hotte à flux laminaire et l'incubateur (Tchao, 1996).Cet effet est souvent plus prononcé dans les cultures sans sérum. Electricité statique Les charges électrostatiques qui s'accumulent sur la surface en plastique peuvent aussi nuire à l'adhésion des cellules. Ce problème se produit plus fréquemment lorsque l'humidité relative est très faible en hiver (ou toute l'année suivant la localisation du laboratoire). L'essuyage de l'extérieur des flacons avec une serviette propre et humide; l'augmentation de l'humidité ambiante, ou l'utilisation d'un dispositif antistatique disponible dans le commerce peut éliminer ou réduire ce problème. Des précautions doivent également être prises pour éviter le frottement des flacons contre les emballages lors de leur ouverture (pour les rollers en particulier) car cela peut accroître la charge statique. Effet de ménisque Lorsque le volume de milieu de culture est trop faible par rapport à la surface du flacon, un profil indiquant une croissance plus dense peut apparaître sur les bords du flacon ou un profil en anneau ou en halo est observé dans les boîtes (cet effet de halo est souvent plus prononcé dans les plaques multi-puits). Ces profils sont observés car l'effet de ménisque entraine une quantité de milieu donc une densité cellulaire supérieure le long des côtés du flacon par rapport au centre. Un effet identique est observé lorsque trop peu de milieu est ajouté lors des phases de réalimentation. La "règle d'or» est d'utiliser 0,2 à 0,3 ml de milieu par centimètre carré de surface de croissance (Table 1). Mycoplasmes Bien que le problème de contamination des cultures de cellules sorte du sujet de ce guide, il est important d'attirer l'attention sur cette source très fréquente de problèmes d'adhésion et de croissance. Pour plus d'informations sur les problèmes de contamination des cultures de cellules, se référer à Lincoln et Gabridge, 1998; Rottem et Barile, 1993; McGarrity, 1982; McGarrity, 1976. En raison de la densité très élevée qu'ils peuvent atteindre dans la culture (jusqu'à 108/mL), les mycoplasmes (contrairement à d'autres contaminants tels que les bactéries et les champignons) peuvent causer de graves effets indésirables sur les cultures cellulaires sans opacification du milieu et sans pouvoir être détectés au microscope. Les mycoplasmes se développent souvent

5 en adhérant à la membrane cellulaire. Par conséquent, une seule cellule peut avoir plusieurs centaines de mycoplasmes sur sa membrane ce qui affecte grandement sa capacité à se fixer et à se développer. Une procédure de dépistage régulier des mycoplasmes est une exigence essentielle pour tous les laboratoires de culture cellulaire travaillant avec des lignées cellulaires (Lincoln et Gabridge, 1998; Masover et Buck, 1983; McGarrity et al, 1985; McGarrity, 1982). Sans une telle procédure, des contaminations par des mycoplasmes, ainsi que les problèmes associés, sont susceptibles de se produire à tout moment. Problèmes de croissance en bouteille " roller » Le mouvement constant du milieu à la surface de la bouteille, aussi lent qu'il peut sembler, peut rendre l'adhésion et la croissance cellulaire plus difficiles en roller en comparaison des autres types de flacons et boîtes. Le mouvement constant du milieu peut aussi conduire à un environnement plus stressant pour la cellule par rapport aux conditions de culture fixes. Par conséquent, tous les points techniques qui réduisent la capacité de fixation des cellules sont amplifiés (Freshney, 1994). Il faut une fois de plus noter que beaucoup de ces problèmes de croissance ne sont pas détectables par l'observation microscopique de routine des cultures vivantes. Les observations sur les échantillons d'abord fixés puis colorés sont plus sensibles lorsqu'il s'agit d'identifier un problème. Adhésion cellulaire non homogène et agglomération L'un des problèmes les plus fréquemment rencontrés avec les rollers est la difficulté à obtenir une monocouche de cellules adhérentes dans le flacon. Une vitesse de rotation non adaptée en est la cause la plus fréquente. Si la vitesse de rotation est trop élevée, des zones de plus forte densité cellulaires apparaissent après fixation et coloration en bandes circulaires aux deux extrémités du roller (Figure 3). Figure 3 Ceci est provoqué par un flux de milieu légèrement plus lent au niveau des extrémités du flacon par rapport au centre. Une vitesse de rotation trop rapide peut également résulter en une agrégation massive des cellules. Ceci résulte de la tendance des cellules à former des amas s'il est plus facile d'adhérer les unes aux autres plutôt qu'à la surface du roller. Finalement, ces amas cellulaires deviennent suffisamment gros pour adhérer à la surface de la bouteille. Une vitesse de rotation de 0,5 à 1,0 tours par minute (tr / min) pour commencer est recommandée. Toutefois, si les cellules ont des difficultés de fixation, des vitesses plus lentes (0,1 à 0,4 tr / min) doivent être utilisées jusqu'à ce que les cellules adhèrent. Les dommages cellulaires lors des repiquages ou l'inactivation ou la suppression incomplète des enzymes de dissociation peuvent également rendre l'adhésion plus difficile. Les récepteurs protéiques cellulaires à la base de l'adhésion cellulaire sont alors endommagés et doivent se renouveler pour que les cellules adhèrent. Une température d'incubateur mal régulée (températures trop élevées ou trop faibles) peut aussi limiter l'adhésion cellulaire en roller.

6 Si la vitesse de rotation est initialement trop lente, ou si les rollers s'arrêtent de tourner par glissement même pendant une courte période au cours de la période de fixation initiale de cellules, des bandes longitudinales de croissance cellulaire peuvent apparaître. Le nettoyage des rouleaux sur l'appareil doit atténuer le glissement des bouteilles. Si nécessaire, des bandes de caoutchouc peuvent être placés autour des extrémités des bouteilles pour améliorer la traction. Des bandes de croissance forte à une seule extrémité du roller sont souvent le résultat d'un appareil à rouleaux qui n'est pas de niveau, ce qui provoque une plus grande quantité de milieu et de cellules à une des extrémités du flacon (figure 4). En outre, plus il faut de temps aux cellules pour adhérer, plus elles s'accumulent à l'extrémité basse du roller. Laisser un roller trop longtemps debout à la verticale après l'ensemencement initial peut avoir un effet similaire. Figure 4 Bandes claires Des bandes circulaires claires peuvent apparaitre sur les rollers comme si les cellules avaient été balayées (Figure 5). Bien que de petits débris ou de gros amas de cellules puissent provoquer cela, l'une des causes les plus communes est la présence transitoire de bulles dans l'inoculum initial de cellules. Il est conseillé d'éviter la formation de bulles en versant le milieu avec précaution sur les côtés de la bouteille, ou en le pipetant directement dans le fond des bouteilles. Les suspensions cellulaires utilisées pour inoculer les rollers doivent être soigneusement préparées afin de s'assurer de l'absence de bulles. Figure 5 Présence de traînées La condensation (essentiellement de l'eau pure) tombant sur les cellules peut causer ces profils inhabituels. Ce problème survient généralement lorsque les rollers qui ont été retirés de l'incubateur sont placés debout à température ambiante en attente de traitement. En raison de la différence de température, la vapeur d'eau se condense à l'intérieur du bouchon. Les gouttelettes formées peuvent ensuite fusionner et couler sur les côtés de la bouteille à travers les cellules qui ne sont plus couvertes que par une fine couche de milieu. Ces cellules vont subir un choc osmotique. Si elles ont formé une monocouche confluente, elles peuvent alors se déchirer ou se séparer les unes des autres le long du trajet de la goutte d'eau, ce qui créé une traînée (Figure 6). Les cellules qui n'ont pas atteint la confluence peuvent flotter dans le milieu, laissant derrière elles une longue traînée claire dépourvue de cellules.

7 Figure 6 Décollage Les cellules en monocouche très confluentes (comme les fibroblastes) peuvent se décoller de la surface de la bouteille du roller. Cela se produit également en flacons, en boîtes ou en plaques. Ce n'est pas une conséquence d'un problème de traitement de la surface du flacon, mais de la formation d'une couche de cellules interconnectées étroitement et reliées par une matrice extracellulaire synthétisée. Au fil du temps, des contraintes mécaniques peuvent se développer dans la couche de cellules et provoquer des déchirures ou des détachements de la surface du roller (Figure 7). Les dommages physiques de pipetage directement sur la couche de cellules ou d'autres manipulations peuvent également provoquer ce type de décollaement. Figure 7 References 1. Amstein, C.F.; Hartman, P.A.: Adaptation of Plastic Surfaces for Tissue Culture by Glow Discharge. J. Clin. Microbiol. 2:46¬54, 1975. 2. Brock, T.D.: Membrane Filtration: A User's Guide and Reference Manual. Madison, Wisconsin: Science Tech, 1983. 3. Burke, C. N.; Croxall, G.: Variation in Composition of Media and Reagents Used in the Preparation of Cell Cultures From Human and Other Animal Tissues: Dulbecco's, Earle's, and Hank's Balanced Salt Solutions. In Vitro 19: 693¬698, 1983. 4. Freshney, R.I.: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. New York: Allan R. Liss, Inc. Third Edition, 1994. 5. Hudis, M. Plasma Treatment of Solid Materials. in Hollahan, J. R.; Bell, A. T.; Ed. Techniques and Applications of Plasma Chemistry. New York: John Wiley and Sons, 113¬147, 1974. 6. Jakoby, W. B. and Pastan, J. H.: Ed. Methods in Enzymology: Cell Culture. (Especially Chapters 1, 2, 5, 7 and 10) Vol. 58, New York: Academic Press, 1979. 7. Lincoln, C.K. and Gabridge, M.G. Cell Culture Contamination: Sources, Consequences, Preven¬tion and Elimination. In Animal Cell Culture Methods, edited by J. P. Mather and D. Barnes, Methods in Cell Biology, Volume 57, Chapter 4, Academic Press, San Diego, 49¬65, 1998. 8. MacMichael, G. J.: The Adverse Effects of UV and Short Wavelength Visible Radiation on Tissue Culture. American Biotechnology Laboratory: July/August, 1986.

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