[PDF] Chapitre V : Cinétique enzymatique 5.1 Phases de la réaction

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Matière : Enzymologie

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Chapitre V : Cinétique enzymatique

Introduction :

étude

donnée. Elle donne de renseignement sur la formation du complexe enzyme-substrat et sur la notion renseignements seront surtout utiles à la compréhension de certains mécanismes de régulation de chaînes donner produit de réaction à lieu, produit qui est finalement libéré. L'étude cinétique d'une réaction enzymatique consiste en l'étude de la vitesse de réaction et de l'influence de différents paramètres susceptibles de la modifier. Dans une réaction enzymatique : il y a 3 paramètres variables fondamentaux qui sont : -Le t - pH, température

5.1 Phases de la réaction enzymatique

Lorsque une enzyme est mis en présence de son substrat généralement sous forme de solution. La combinaison enzyme-substrat(E-S) est rapide, cette situation est la plus simple, particulièrement lorsque le substrat est en large excès. Cette étape initiale, appelée phase préstationnaire, de milliseconde. A la fin de cette phase commence la phase stationnaire par son substrat (S) et la combinaison [ES] est à concentration maximale est constante et

zéro(0). Dès que la concentration du substrat diminue de manière significative, ce qui apparait

(de quelque minutes à quelques phase stationnaire. La figure ci-dessous schématise en terme de : substrat de combinaison substrat[ES] et de produit [P]

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5.2. Hypothèse de Michaelis et Menten

En 1913 Michealis et Menten

enzymes et de la cinétique enzymatique. former la combinaison(E-S), ce dernier se décompose dans une deuxième étape pour Cette réaction se décompose en 02 étapes:

1-F-substrat (ES) :

La transformation du substrat en produit, se fait obligatoirement par le passage un état intermédiaire : le complexe enzyme substrat. -étape rapide et réversible. V1

E + S E S (2)

V2 V1 et k1 sont les vitesse et constante de formation du complexe ES , V2 et k2 les vitesse et constante de dissociation du complexe ES.

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2- Dissociation de la combinaison(ES) et formation du produit P:

Ǧ La deuxième étape correspond à la formation du produit à partir du complexe activé.

Ǧ Étape plus lente.

V3 K3

ES E + P (3)

V3 et k3 sont la vitesse et constante de formation du produit P. -dessus(3) : -Disparition du substrat S -Apparition des produits(P) de la réaction. -E. La vitesse de disparition du substrat S( -dS/dt) (- parce que la [S] diminue) est égale à la vitesse de formation des produits de la réaction dP :

-dS/dt = dP/dt (4)

Cette vitesse de disparition du substrat est égale à la différence des vitesses V1 et V2 de (2). -dS/dt = V1 V2

V1= K1 [E].[S]

V2= K2[ES]

de la réaction est : dP/dt = V3= K3[ES] (5)

Puisque dP/dt = -dS/dt on a : V1 - V2 = V3

: K1[E].[S] - K2 [ES] = K3[ES] K1[E].[S] = [ES](K2 + K3) -dessus, on obtient: [E].[S]/[ES] = K2+ K3 / K1 =Km (6) La constante Km ou constante de dissociation de la combinaison [ES] qui remplace le terme K2+ K3/ K1 est appelé constante de Michaelis (exprimée en mole/litre). plus élevée que la dissociation de la combinaison pour le substrat (S) est plus faible.

Si Km .

5.3.Equation de Michaelis Menten

Soit réactionnel.[E] la

] sera : [E] = [ET] - [ES] équation 6), en substituant [E] par sa valeur et Km devient : [E]. [S]/[ES] =K2+ K3/K1 = Km

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Km = [E].[S]/ [ES] = ( [ET]-[ES]).[S]/ [ES]

Km = [ET][S]/ [ ES] - [ES][S] / [ES]

= [ET][ S] / [ES] - [S] n ci-dessus

Km + [S]= [ET][S]/ [ES]

[ES]= [ET][S] / Km + [S] (7) Ou la vitesse V de la réaction enzymatique est égale à V3

V = V3 = K3 [ES] (8)

V = K3[ET][S] / Km+[S] (9)

La vitesse de la réaction dépend donc :

-enzyme [ET]. -la concentration du substrat [S). -de la constante de michaelis (Km). possible, -à- : [ES] = [ET]

Dans ce cas Vmax =K3[ET] (10)

chaque instant devient

V = vmax.[S] / Km +S] équation de Michaelis (11)

-Menten décrit la courbe cinétique de V= f(S): - Pour des concentrations faibles de substrat, lorsque [S] << Km, V = [S]Vmax/Km et la vitesse est directement proportionnelle à la concentration de substrat. - Pour des concentrations élevées de substrat, lorsque [S] >>Km, V = Vmax et la vitesse est indépendante de la concentration de substrat. - La signification de la constante Km est évidente. Lorsque [S] = Km, V = Vmax /2. Km est la concentration de substrat nécessaire pour que l'enzyme atteint (1/2) Vmax.

5.3.1Rep-Menten

V = vmax.[S] / Km +[S]

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Expression graphique de v= f(x)

5.3.2 Méthodes de détermination de la constante de Michaelis(Km)

5.3.2.1.Méthode arithmétique :

V = Vmax/2 on aura Vmax/2 = Vmax.[S]/ Km+[S]

2Vmax[S] = Vmax(Km + [S])

2 Vmax/Vmax = Km +[S]/ [S]

2[S] = Km +[S] (12)

De ce résultat on peut conclure que la constante de Michaelis (Km) est égale à la

concentration du substrat[S] lorsque la vitesse (V) de la réaction est égale à la moitié de la

vitesse maximale (Vmax).

Pour toute réaction selon Michaelis-Menten:

Km = [S] => v=Vmax/2

est une mesure de [S] requise pour une catalyse effective. est grand, plus [S] est élevé pour réaliser une certaine vitesse de réaction.

5.3.2.2.Méthodes graphiques

Une hyperbole est difficile à tracer manuellement. -Des erreurs sur l'estimation de la Vmax sont possibles.

Km = [S]

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M2 BA H.B 6 -Pour simplifier la représentation graphique de l'équation de MICHALEISMENTEN(équation

11), peut être s, des transformations les plus

utilisées consistent simplement à prenichaelis-Menten.

A)-Méthode graphique de Lineweaver-Burk :

V= Vmax.[S]/ Km + [S] son inverse est : 1/V = Km +[S] / Vmax.[S]

1/ V = Km/ Vmax[S] + [S]/ Vmax[S] cette equation se simplifie en

(13) -Burk, qui représentée par une ligne droite de la forme : Y = a x + b Où 1/V = f(1/[S] sa pente a= Km/Vmax son ordo : b= 1/Vmax Pour 1/V = 0 Km/ Vmax(1/[S] = - Point A

Pour 1/V = 2/Vmax

2/Vmax = Km/Vmax(1/[S]) +1/Vmax 1/[S] = 1Km point B

Pour 1/S =0 1/V =1/Vmaxk

Donc la représentation graphique est la suivante : -La détermination de la valeur de la constante de Michaelis(Km) est donc immédiate, lorsque la droite de Lineweaver-Burk est tracée. -pour cette présentation graphique, il suffit de 2 à 3 points pour la tracer.

-Cette méthode est très utilisée et importante sur le plan pratique : permet donc les calculs de

Vmax et Km.

1/V = Km/Vmax .1/[S] + 1/Vmax

1[S] = - 1/Km

1/[S] =1/Km

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M2 BA H.B 7 -Elle permet aussi la mise en évidence simple des inhibiteurs de la réaction enzymatique.

Signification de la constante de Michaelis(Km) :

constantes K1 et K2. réaction

K3 selon la réaction(10) K3 = Vmax/ ET.

B)- Représentation Eadie-Hofstee

Cette représentation fût publiée par George Eadie en 1942 et Baren Hofstee en 1959 : -Menten V = Vmax[S]/ Km +[S] On divise le numérateur et dénominateur par [S]

Soit V= Vmax.[S]/[S] /Km +[S]/[S]

V= Vmax/ Km/[S] +1

Vmax= V( Km/[S] +1)

Vmax= VKm/[S] +V

Si V/[S]=0 V = Vmax

Si V =0 V/[S] = Vmax/ Km -Hofstee

Cette représentation est une droite de pente

C)- Représentation de Hanes-Woolf

Cette représentation fût publiée par Charles Hanes et Barnet Woolf en 1932 :

V= Vmax- VKm/[S] ou V = - KmV/[S] + Vmax

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M2 BA H.B 8 [S]/v = f [S] le inverse de Lineweaver-burk dans la forme ci-dessous :

1/V = Km/Vmax .1/[S] + 1/Vmax

[S]/V = [ S]. Km/Vmax .1/[S] + [S]/ Vmax Si [S]/V =0 [S] = - Km Si [S] =0 [S]/ V = Km/Vmax.

Représentation graphique de Hanes-Wolf

Cette représentation est une droite de pente de 1/Vmax et qui coupe l'axe des [S] au point (- Km). [S]/V = [S] /Vmax +Km/Vmaxquotesdbs_dbs46.pdfusesText_46

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