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THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

DE L'UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER

En Biologie Santé

Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé - CBS2 Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier (IRCM) - INSERM U1194

Présentée par Zahra AL AMIR DACHE

Le 20 Novembre 2019

Sous la direction de Alain THIERRY

Et Corinne PREVOSTEL

Devant le jury composé de

Mr. Gregory LAVIEU, CR, Centre de recherche de l'Institut Curie, Paris Mr. Alain BRISSON, Pr, Institut de chimie & biologie des membranes & des nano-objets, Bordeaux

Mme. Marie-Luce VIGNAIS, CR, Institut de médecine régénératrice et de biothérapie de Montpellier, Montpellier

Mme. Mona DIAB ASSAF, Pr, Université Libanaise, Liban Mr. Alain THIERRY, DR, Institut de recherche en cancérologie de Montpellier, Montpellier Mme. Corinne PREVOSTEL, CR, Institut de recherche en cancérologie de Montpellier, Montpellier Rapporteur Rapporteur Examinatrice Présidente Directeur Co-Directrice Étude de la structure de l'ADN circulant d'origine mitochondriale

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Résumé

Le plasma transporte des cellules sanguines avec un mélange de composés, y compris les nutriments, déchets, anticorps, et messagers chimiques... dans tout l'organisme. Des facteurs

non solubles tels que l'ADN circulant et les vésicules extracellulaires ont récemment été

ajoutés à la liste de ces composants et ont fait l'objet d'études approfondies en raison de leur

rôle dans la communication intercellulaire. Or, l'ADN circulant (ADNcir) est composé de

fragments d'ADN libres ou associés à d'autres particules, libérés par tous les types cellulaires.

Cet ADN est non seulement de l'ADN génomique mais aussi de l'ADN mitochondrial extra- chromosomique. De nombreux travaux réalisés au cours des dernières années indiquent que l'analyse quantitative et qualitative de l'ADNcir représente une avancée dans les applications cliniques en tant que biomarqueur non invasif de diagnostic, de pronostic et de suivi thérapeutique. Cependant, malgré l'avenir prometteur de cet ADNcir dans les applications cliniques, notamment en oncologie, les connaissances sur ses origines, sa composition et ses fonctions qui pourraient pourtant permettre d'optimiser considérablement sa valeur diagnostique, font encore défaut.

Le principal objectif de ma thèse a été d'identifier et de caractériser les propriétés structurales

de l'ADN extracellulaire d'origine mitochondrial. En examinant l'intégrité de cet ADN, ainsi que

la taille et la densité des structures associées, ce travail a révélé la présence de particules

denses d'une taille supérieure à 0,2 µm contenant des génomes mitochondriaux complets et non fragmentés. Nous avons caractérisé ces structures notamment par microscopie

électronique et cytométrie en flux et nous avons identifié des mitochondries intactes dans le

milieu extracellulaire in vitro et ex-vivo (dans des échantillons de plasma d'individus sains). Une consommation d'oxygène par ces mitochondries a été détectée par la technique du Seahorse, suggérant qu'au moins une partie de ces mitochondries extracellulaires intactes pourraient être fonctionnelles.

Par ailleurs, j'ai participé à d'autres travaux réalisées dans l'équipe, dont (1) une étude visant

à évaluer l'influence des paramètres pré-analytiques et démographiques sur la quantification

d'ADNcir d'origine nucléaire et mitochondrial sur une cohorte composée de 104 individus

sains et 118 patients atteints de cancer colorectal métastatique, (2) une étude dont l'objectif

était d'évaluer l'influence de l'hypoxie sur le relargage de l'ADN circulant in vitro et in vivo, et

(3) une étude visant à évaluer le potentiel de l'analyse de l'ADN circulant dans le dépistage et

la détection précoce du cancer.

Ce manuscrit présente une synthèse récente de la littérature sur l'ADNcir, ses différents

mécanismes de relargage, qui vont de pair avec la caractérisation structurelle de cet ADN, ses

aspects fonctionnels et ses différentes applications en cliniques. De plus, cette thèse apporte

des connaissances nouvelles sur la structure de l'ADN mitochondrial extracellulaire tout en ouvrant de nouvelles pistes de réflexion notamment sur l'impact que pourrait avoir la présence de ces structures circulantes sur la communication cellulaire, l'inflammation et des applications en clinique.

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Abstract:

Plasma transports blood cells with a mixture of compounds, including nutrients, waste, antibodies, and chemical messengers...throughout the body. Non-soluble factors such as circulating DNA and extracellular vesicles have recently been added to the list of these components and have been the subject of extensive research due to their role in intercellular communication. Circulating DNA (cirDNA) is composed of cell-free and particle-associated DNA fragments, which can be released by all cell types. CirDNA is derived not only from genomic DNA but also from extrachromosomal mitochondrial DNA. Numerous studies carried

out lately indicate that the quantitative and qualitative analysis of cirDNA represents a

breakthrough in clinical applications as a non-invasive biomarker for diagnosis, prognosis and therapeutic follow-up. However, despite the promising future of cirDNA in clinical applications, particularly in oncology, knowledge regarding its origins, composition and functions, that could considerably optimize its diagnostic value, is still lacking. The main goal of my thesis was to identify and characterize the structural properties of extracellular DNA of mitochondrial origin. By examining the integrity of this DNA, as well as the size and density of associated structures, this work revealed the presence of dense particles larger than 0.2 µm containing whole mitochondrial genomes. We characterized these structures by electron microscopy and flow cytometry and identified intact mitochondria in the extracellular medium in vitro and ex vivo (in plasma samples from healthy individuals). Oxygen consumption by these mitochondria was detected by the Seahorse technology, suggesting that at least some of these intact extracellular mitochondria may be functional. In addition, I contributed to other studies carried out in the team, such as studies aiming at evaluating (1) the influence of pre-analytical and demographic parameters on the quantification of nuclear and mitochondrial cirDNA on a cohort of 104 healthy individuals and

118 patients with metastatic colorectal cancer, (2) the influence of hypoxia on the release of

cirDNA in vitro and in vivo, and (3) the potential of cirDNA analysis in the early detection and screening of cancer. This manuscript present a recent review on cirDNA and its different mechanisms of release, which go hand in hand with the structural characterization of this DNA, its functional aspects and its clinical applications. In addition, this thesis provides new knowledge on the structure of extracellular mitochondrial DNA and opens up new avenues for reflection, particularly on the potential impact that could have those circulating mitochondria on cell-cell communication, inflammation and clinical applications.

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"It's the one thing you can control. You are responsible for how people remember you-or don't. So don't take it lightly"

Kobe Bryant

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Remerciements :

Aujourd'hui, après ces trois années de thèse, je suis convaincue que ce travail est très loin d'être

individuel. C'est l'occasion de repenser à toutes les personnes qui m'ont permis d'en arriver là

et de réaliser ce modeste travail, par leurs conseils, leur intérêt manifesté à l'égard de mon

projet et surtout leur bonne humeur et soutien. Je souhaite dans un premier temps remercier les membres de mon jury de thèse. A monsieur le docteur Gregory LAVIEU, Je suis très honorée que vous ayez accepté de faire partie de mon jury de thèse en tant que rapporteur. C'est également avec plaisir que je vous remercie pour les remarques judicieuses et les suggestions que vous m'avez adressées dans votre rapport et durant la thèse et qui ont permis d'améliorer énormément mon manuscrit. A monsieur le professeur Alain BRISSON, Vous m'avez fait l'honneur d'être rapporteur de ce travail et de faire partie de mon jury. Je tiens également à vous remercier pour le temps que

vous avez consacré à la lecture de ma thèse ainsi que pour les remarques constructives et les

critiques m'ayant permis de le perfectionner et de l'affiner. A Mme le docteur Marie-Luce VIGNAIS, je tiens à vous remercier pour l'intérêt que vous avez

porté à mon travail de thèse en vous engageant en tant qu'examinatrice. Je vous remercie pour

le temps consacré à la lecture de ce travail ainsi que pour les critiques que vous m'avez adressées. A Mme le professeur Mona DIAB ASSAF, je tiens à vous remercier, non seulement pour avoir

accepté d'être membre de mon jury de thèse en tant qu'examinatrice de ce travail, mais aussi

pour toutes les opportunités que vous m'avez accordées durant mon master en Cancérologie

à l'université libanaise.

A monsieur le professeur Christian JAY-ALLEMAND, je vous exprime mes remerciements pour

votre disponibilité et accompagnement pendant les trois années de ma thèse, en étant

membre de mon comité, et également pour l'honneur que vous me faites en participant à mon jury et en acceptant d'examiner mes travaux.

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A mes directeurs de thèse, ce fut un plaisir et un grand honneur de travailler sous votre direction. Monsieur Alain THIERRY, Je vous adresse mes remerciements les plus sincères pour votre encadrement, votre garantie d'excellentes conditions de travail, et vos multiples conseils tout

au long des années d'étude, qui m'ont permis de pouvoir être fière aujourd'hui du travail

réalisé. Je suis reconnaissante pour la confiance que vous m'avez accordée dès le début, et

dont j'espère avoir été à la hauteur. Merci aussi pour vos critiques constructives tout en disant

de temps de temps que nous faisons du bon boulot. Vous m'avez beaucoup apporté aussi bien au niveau scientifique que personnel. Je vous souhaite le meilleur pour votre nouvelle direction d'équipe et pour tous vos futurs projets. Mme Corinne PREVOSTEL, Je tiens à te remercier énormément pour ta disponibilité (même quand j'envoyais des messages à minuit), la patience dont tu as fait preuve, pour tes qualités

humaines et surtout ta gentillesse. J'ai beaucoup apprécié travailler à tes cotés tant sur le plan

scientifique que sur le plan humain. Je garde toujours beaucoup de plaisir à discuter avec toi

et à bénéficier de tes précieux conseils. Merci pour ton encouragement non-stop. Je ne sais pas

trop m'exprimer mais je te promets d'agir comme toi envers les étudiants que je pourrai guider, si un jour l'occasion m'en est donnée. Aux membres de mes comités de thèse, Mme Julie PANNEQUIN, Monsieur Christian JAY- ALLEMAND et Monsieur Tamim SALEHZADA, merci pour vos disponibilités, vos conseils, vos questions et lumières apportés à ce travail de thèse.

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A monsieur Claude SARDET, je vous remercie de m'avoir accueillie au sein de l'IRCM. A monsieur Marc YCHOU, Je vous remercie de m'avoir accueillie au sein de votre équipe " Recherche intégrée pour une médecine personnalisée en oncologie digestive ». Je tiens à remercier tous les membres de l'équipe, Marc, Evelyne, Caroline, Philippe, Antoine, Thibault, pour la très bonne ambiance, pour les intéressantes discussions durant les lab- meeting, pour vos aides et disponibilités sans faille et surtout votre bonne humeur. Plus spécialement, à Laurence, je ne te remercie pas juste pour ton immense aide scientifique et technique et ta disponibilité en tout instant mais pour tous les moments précieux qu'on a passés. Je te considère plus qu'un collègue de travail, mais plutôt ma grande soeur J A Jean-Daniel, merci pour nous avoir supporté chaque jour à midi avec nos conversations quiquotesdbs_dbs4.pdfusesText_8

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