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Lycée Valentine Labbé (59) • Classe préparatoire TB • SVT • Sciences de la Vie • Complément BIO6 : Quelques techniques de biologie moléculaire, génie génétique et biotechnologies

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ENSEIGNEMENT DE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE (SVT)

°° SCIENCES DE LA VIE °°

Complément BIO6

Quelques techniques de biologie

moléculaire, génie génétique et biotechnologies

Une courte introduction en attendant le cours

de Biotechnologies

Introduction

Les techniques de biologie moléculaire regroupent, au sens le plus large, l'ensemble des techniques permettant l'étude et la manipulation des molécules biologiques. Dans les faits, on entend surtout derrière ce terme les techniques modernes d'étude des macromolécules biologiques (protéines, acides nucléiques), notamment les acides nucléiques. Dans une approche plus appliquée aux besoins humains, on peut parler de biotechnologies pour désigner ce que l'OCDE propose de définir comme " l'application des principes scientifiques et de l'ingénierie à la transformation de matériaux par des agents biologiques pour produire des biens et services ». Les biotechnologies incluent notamment le génie génétique qui désigne l'ensemble des techniques permettant l'utilisation ou la modification du génome des organismes. Parmi ces techniques, on peut citer la technique centrale que le programme invite à étudier : la transgénèse qui est la production d' organismes génétiquement modifiés (OGM) ou organismes transgéniques , c'est-à-dire d'organismes exprimant un gène extérieur (nommé gène d'intérêt ) à leur espèce ajouté artificiellement par l'homme à leur génome ( figure 1

Comment les progrès de la biologie moléculaire permettent-ils l'étude des macromolécules aujourd'hui ? Comment le génie génétique permet-il la production d'organismes génétiquement modifiés (OGM) ?

G

FIGURE

1. Un lapin transgénique (lapin GFP). La Green Fluorescent Protein (protéine de florescence verte) est une protéine initialement exprimée par des Méduses

et dont le gène a été transféré à de nombreux organismes par transgénèse. http://sciences-et-cetera.fr/bio-arts/ (consultation décembre 2015).

Important : ce document constitue une adaptation d'un polycopié produit en ATS Bio ; je n'ai pas voulu le dénaturer en le modifiant mais il est évidemment beaucoup trop simplifié par rapport à la plupart des compétences qui sont attendues de vous.

Il ne saurait remplacer votre enseignement

de Biotechnologies. Les méthodes de séquençage ne sont pas abordées ici.

Lycée Valentine L

ABBÉ

41 rue Paul D

OUMER - BP 20226

59563 L

A MADELEINE

CEDEX

CLASSE PRÉPARATOIRE

TB (Technologie & Biologie)

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I. Techniques de base d"étude des macromolécules À l'heure de la génomique et de la protéomique, la biologie moléculaire a par

ailleurs bénéficié ces dernières années du développement et de la baisse du coût

de nombreuses techniques devenues d'emploi quotidien dans les laboratoires. A. Séparation, purification et isolement de macromolécules L'une des premières tâches possibles pour un biochimiste ou un biologiste moléculaire, c'est la séparation des molécules d'un mélange de manière à les

identifier et/ou obtenir une molécule " pure », libérée du mélange dont elle est

extraite.

1. Séparation par migration dans un solvant (= éluant) : les chromatographies

a. Principe général Une chromatographie est basée sur la migration d'une phase mobile (mélange dont on veut séparer les constituants), généralement sous l'effet d'un solvant qu'on nomme éluant, sur une phase fixe (support de migration), la différence d'affinité entre les deux phases étant responsable de la migration différentielle des constituants de la phase mobile. Voir

TP 2.7

(Photosynthèse) : chromatographie de pigments photosynthétiques Classiquement, l'identification d'une molécule se fait par calcul d'un rapport frontal (rapport de la distance de migration de la molécule sur la distance de migration de l'éluant) ( page ci-contre b. Aperçu de la diversité des techniques

Un aperçu des techniques est proposé par le

tableau I

On peut citer les techniques suivantes :

y

Chromatographie sur papier W

HATMAN

: migration ascendante de l'éluant par capillarité dans un papier spécifique (figure 2 y

Chromatographie sur couche mince

: migration ascendante de l'éluant sur une couche siliceuse qui retient* plus ou moins les constituants ( figure 2 y

Chromatographie sur colonne

: migration descendante de l'éluant sur une couche de petites billes qui retiennent* plus ou moins les composés. On peut ainsi récupérer les différents composés à des temps différents d'élution. o

Chromatographie sur colonne échangeuse d'ions

(figure 3 ) : les billes retiennent* les composés selon leur charge. o

Chromatographie d'affinité

(figure 4 ) : sur les billes est fixé un ligand qui retient* seulement les protéines qui peuvent se fixer au ligand. o

Chromatographie d'exclusion

(figure 5 ) : les billes laissent passer les composés en fonction de leur taille. * La fixation d"un composé à la surface d"un support fixe s"appelle adsorption. F

TABLEAU

I. Quelques techniques de chromatographies : un comparatif.

D'après D

ENOEUD

et al. (2010).

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G

FIGURE

2. Chromatographie sur papier ou gel de silice. D'après B

REUIL (2007). G

FIGURE

3. Chromatographie sur colonne échangeuse d'ions. D'après B

REUIL (2007). G

FIGURE

4. Chromatographie d'affinité. D'après B

REUIL (2007). G

FIGURE

5. Chromatographie d'exclusion. D'après B

REUIL (2007).

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2. Séparation par migration dans un champ électrique : les électrophorèses

Une

électrophorèse

est une séparation des constituants d'un mélange selon leur capacité à migrer dans un champ électrique ( figures 6-7 ). Cette technique est fréquemment utilisée sur les protéines ou les acides nucléiques. Elle peut se faire sur du papier mais se fait généralement sur gel d'agarose ou de polyacrilamide. Des puits sont creusés dans le gel où sont déposés les

mélanges à étudier (souvent colorés) ; un des puits contient généralement un marqueur de taille/masse

qui servira de référence pour évaluer la taille/masse des substances migrant sur les autres pistes. Les protéines sont généralement étudiées en conditions dénaturantes dites SDS PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate PolyAcrilamide Gel Electrophoresis), ce qui permet de s'assurer que la migration des protéines est simplement due à leur masse et non leur charge (neutralisée par le SDS) ( figure 6 G

FIGURE

6. Principe de l'électrophorèse, notamment SDS PAGE. D'après D

ENOEUD

et al. (2013). Dans le cas des acides nucléiques, le marqueur est un marqueur de taille : on évalue la longueur en pb des fragments d'ADN ou d'ARN présents initialement dans les puits.

Dans le cas des protéines, le marqueur est un

marqueur de masse : on évalue la masse (en Da ou plutôt kDa) des protéines. Les macromolécules de taille/masse importante migrent plus lentement que celles de taille/masse plus faible. Une électrophorèse permet l'obtention d'un

électrophorégramme

ou profil

électrophorétique

G

FIGURE

7. Déroulement d'une électrophorèse (pour information).

D'après D

ENOEUD

et al. (2013).

3. D"autres méthodes applicables

Les méthodes classiques de la chimie (distillation, montage à reflux, entraînement par la vapeur...) ou de la biologie (centrifugation, dialyse au

travers d'un sac à pores de taille connue...) peuvent aussi être appliquées à la

séparation et la récupération de macromolécules. Les ultracentrifugations sont particulièrement utilisées avec les acides nucléiques.

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