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Délivré par l'université de MONTPELLIER

Préparée au sein de l"école doctorale CBS2 n°168

Et de l"unité de recherche IRCM U1194

Spécialité : Biologie Santé

Présentée par Romain RISCAL

Soutenue le 30/09/2016 devant le jury composé de

M. le Pr Paul MANGEAT Président du jury

M. le Dr Laurent LE CAM Directeur de Thèse

Mme le Dr. Laëtitia LINARES Co-directrice de Thèse

Mme le Dr. Sophie VASSEUR Rapporteur

M. le Dr Jean Christophe MARINE Rapporteur

M. le Dr Jean Emmanuel SARRY

M. le Dr Lluis FAJAS COLL

Examinateur

Examinateur

L'oncogène MDM2 : nouvelles fonctions et

implications dans le métabolisme des cellules cancéreuses E

REMERCIEMENTS

Ours solitaire comme la plupart de mes amis me décrivent c'est très bien entouré par ma famille et par les membres de mon équipe que je suis arrivé au bout de cette aventure tumultueuse qu'est la thèse en un seul morceau. Je vais d'abord remercier les membres du jury, qui me font l'honneur d'avoir accepté de juger ce travail: M Paul MANGEAT, M Lluis FAJAS, M Jean Emmanuel SARRY, Mr Jean

Christophe MARINE et Mme Sophie VASSEUR.

Ensuite mes plus profonds remerciements iront vers mes deux co-directeurs de thèse. Laetitia, merci pour tout ce que tu m'as apporté pendant ces 4 années, tu es une personne généreuse, intelligente, et très investie dans ta recherche scientifique. Investissement que tu répercutes très bien sur tes étudiants pour en obtenir le meilleur. Nous avons formé une belle équipe avec beaucoup de bons moments. Toujours là pour aider et remotiver nous avons ensemble réussi à boucler une longue et belle histoire. Merci de m'avoir accordé toute ta confiance et donné autant de liberté. Je ne peux que te souhaiter le meilleur pour la suite sur le plan professionnel et personnel. Je ne me fais pas de souci pour toi. Au plaisir d'interagir dans le futur lors de mes prochaines aventures scientifiques. Laurent, merci de m'avoir pris dans ton équipe moi le petit Pérolien qui ne parle pas

un mot d'Anglais. Merci également pour ta disponibilité lors de toutes les étapes

importantes d'une thèse et surtout pour les connexions scientifiques et autres que j'ai pu faire grâce à toi notamment lors de nos voyages à Cambridge (DNA Beer) et à Banff (Top less tree mémorable). Je te souhaite aussi le meilleur pour la suite et une bonne expérience aux US avec ta famille. Je tiens ensuite à remercier tous les membres de l'équipe actuelle, avec lesquels on a

réussi à créer une sorte de famille (même si on peut encore visualiser deux sous familles

MDM2 et E4F1) nous ayant permis de mener à bien plusieurs papiers en l'espace de quelques années. Maryse, merci pour ton aide dans les taches quotidiennes du laboratoire ainsi que pour la confection des nombreux plasmides que j'ai pu utiliser lors de ma thèse. Toujours de bonne humeur on aura eu pas mal de fou rire. Berfin, merci pour ton soutien et ta bonne humeur quotidienne même si tu te mets parfois en colère pour un peu de Trizol dans ta poubelle ;). Je te souhaite plein de bonnes choses pour la fin de ta thèse mais ça part bien avec ce PNAS. Laurie, merci d'avoir apporter un peu de Camargue dans cette recherche nordiste

et étrangère notamment à travers ton vocabulaire très feria pour faire simple et poli. Plein

de bonnes choses pour ta future vie de maman. Madi, merci pour le soutien et l'aide lors de ces fameuses révisions. Je te souhaite plein de réussite avec le projet en cours et plein de courage pour finir cette thèse comme il se doit. Giuseppe, merci pour ta bonne humeur et ta gentillesse, tu as emmené le soleil d'Italie avec toi dans ce labo. Merci aussi pour toute l'expertise scientifique que tu m'as apportée personnellement ainsi qu'à mon projet (gros coup de main pendant les F révisions). Je te souhaite plein de bonnes choses dans ta future aventure parisienne avec toute ta famille. Ne te fais pas de souci, MDM2 à la mito ça vaut un gros impact factor ;). Matthieu, le papa, merci pour tout. Grace aux interactions autant personnelles que

scientifiques tu auras grandement contribué à la réussite de cette thèse. J'espère qu'en

post doc je vais trouver quelqu'un pour crier un peu lors de mes blots. Ca motive bien en tout cas. Par la même occasion on passe pour des fous. Voilà ces quelques mots pour tous vous remercier et vous souhaiter encore pleins de bons moments et de réussite au sein de la LLC team. Je tiens aussi à remercier tous les stagiaires qui sont passés par le laboratoire durant ma présence avec plus ou moins de moments partagés, Susie, Mathilde, Nelly, Marjery ou encore le roi du canoë kayak allias Samuel. Mimi, dernières personnes de l'institut à remercier personnellement et pas des moindres. Je tiens à te remercier pour tous les moments passés ensemble, quasiment que des bons parce que si tu pleures je m"échappe attention... :D. Ta disponibilité (changer un milieu en soirée cause de manip à 20000), ton soutien (tu m'auras appris qu'on ne se suicide pas pour un blot :D) et ton apport calorique (je tuerai quelqu'un pour un Cupcake au Nutella)

auront été des moteurs pour mon activité au labo. Bref je suis obligé de faire court sinon je

vais perdre ma réputation d'ours ;). Je tiens à remercier aussi l'ensemble des personnes avec lesquelles j'ai eu la chance

d'interagir au sein de l'institut, je pense à Abdel (je t'en aurais volé des cartons de boîte de

15 en 4 ans), Philou (merci pour ta disponibilité et ta confection de solution toujours aussi

pointue), Geneviève (princesse de l'azote liquide maintenant à la retraite), Cathy (entraide entre novice du métabolisme oblige)... Je ne vais pas m'amuser à citer tout le monde donc merci à tous les membres de l'IRCM. Je vais aussi remercier les équipes extérieures au laboratoire avec lesquelles j'ai eu la chance de collaborer notamment nos amis toulousains pour leur accueil et leurs expertises métaboliques. Je pense à JE et toute son équipe (en particulier Estelle), le papa du métabolisme, merci pour tout ces " brain storming » très constructifs (surtout à minuit au Get Perrier ;D). Merci également à Jean Charles ainsi que toute son équipe (Lara, Florian et Maude) Métatoul pour la partie fluxomique, métabolomique (et alcoolomique au Dublineur aussi). Le meilleur pour la fin, mes remerciements vont bien entendu à ma femme, Marine qui m'aura soutenue tout au long de ma thèse dans les bons comme dans les mauvais moments (surtout quand j'étais bon en rien et mauvais en tout). Un grand merci à notre fils Roméo, qui a apporté toute sa joie de vivre et son amour lors de mes deux dernières années de thèse. Il m'a surtout appris à partir du labo avant 19h30. MERCI Je tiens également à remercier mes parents pour leur soutien tout au long de ma scolarité

sans qui je ne serais jamais allé aussi loin dans mes études. Merci aussi à tous les

membres de ma famille, mes grands parents, mon frère, mes beaux parents et mes amis (Nico, Toto, Vico, Pinpin, Flo ainsi que leurs compagnes). Autant de personnes toujours aussi à l'écoute de mon travail (sans trop comprendre par moment) et surtout présentes pour m"aérer l"esprit l'eau lors de grosses soirées d"apéritifs. G

AVANT-PROPOS

Les cellules produisent de l'énergie et des composants cellulaires pour soutenir la

croissance et la prolifération à travers plusieurs voies métaboliques importantes. La

glycolyse génère du pyruvate qui est converti en acétyl-CoA afin d'alimenter le cycle de l'acide tricarboxylique (TCA). Ce TCA produit du NADH et du succinate importants pour la

chaîne de transport des électrons et génère également des intermédiaires de biosynthèse,

tel que le citrate, qui alimente la voie de synthèse des acides gras. La phosphorylation oxydative dans les mitochondries produit des niveaux élevés d'ATP. A terme la glycolyse aérobie fournie en énergie l"équivalant de 36/38 ATP pour une seule molécule de glucose.

Les voies de biosynthèse génèrent des nucléotides, protéines et lipides nécessaires à la

production de nouvelles cellules filles au cours de la prolifération. Les processus métaboliques sont souvent modifiés pour répondre aux exigences de la prolifération anormale des cellules cancéreuses. Par exemple, l'effet Warburg soutient que les cellules cancéreuses augmentent l'absorption du glucose et donc leur glycolyse même dans des conditions normoxiques, on parle alors de glycolyse aérobie. Récemment, il a

été suggéré que l'utilisation accrue de la glycolyse aide les cellules cancéreuses à

maintenir de hauts taux de prolifération via la production d'intermédiaires glycolytiques qui alimentent les voies biosynthétiques nécessaires à la production de nouvelles cellules. La plupart des oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs permettent l"expression de

protéines favorisant la prolifération cellulaire ou l'arrêt du cycle cellulaire. Au cours des

dernières années, nous avons appris que la prolifération était étroitement couplée avec

des changements métaboliques. Pour cette raison, le métabolisme cancéreux est un domaine de recherche prometteur étant donné que le métabolisme des cellules

cancéreuses peut être exploité en vue d"établir de nouvelles approches thérapeutiques.

Conformément à la fonction normale de leurs protéines codées, oncogènes ou suppresseurs de tumeurs régulent le métabolisme cellulaire. Ceci est une partie

intrinsèque de leur programme visant à réduire ou à favoriser la prolifération cellulaire. Les

oncogènes favorisent l'absorption et le métabolisme des nutriments comme le glucose indispensable à la synthèse de lipides, nucléotides et protéines. p53, un suppresseur de tumeur bien connu intervient dans une multitude de voies métaboliques via l'activation ou la répression de nombreux gènes clés du métabolisme. Parmi ces voies on retrouve des gènes impliqués dans la glycolyse, la voie des pentoses phosphates, la phosphorylation oxydative, le métabolisme des lipides ou encore celui de certains acides aminés comme la glutamine ou la sérine.

Quant au possible rôle des régulateurs de p53 dans le métabolisme énergétique, leur

étude suscite trop peu d'intérêt. Cependant l'un d'entre eux, MDM2, a attiré toute mon attention lors de mes travaux de thèse. Dans ce manuscrit, une partie introductive sera consacrée à l'oncogène MDM2, ses différentes fonctions et son ciblage thérapeutique en perspective d'établir de nouvelles

thérapies dans les cancers humains. Dans la suite de l"introduction, je décrirai les

principales voies métaboliques en cours d"études, et leurs rôles dans le cancer. Enfin je finirai cette introduction avec les facteurs de transcription ATF nouveaux acteurs du métabolisme en réponse aux stress comme les carences en acides aminés et les stress oxydatifs. Dans une seconde partie, je présenterai mon article qui regroupe l'ensemble

des résultats de cette thèse. Une dernière partie sera enfin consacrée à une discussion

générale et une remise en perspective de l"ensemble de cette thèse. H

TABLE DES MATIERES

Remerciements: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p2-3

Avant propos: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p4

Index des figures: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p8

Liste des abréviations: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p9-11

Introduction:

I - Le suppresseur de tumeur p53:

1) Les fonctions de p53: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p13-14

2) Les principaux régulateurs de p53: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p15

3) p53 et métabolisme: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p16-18

a) p53 régule la phosphorylation oxydative. b) p53 régule la glycolyse: c) p53 régule la glutaminolyse et le métabolisme des lipides: d) p53 régule les défenses anti-oxydantes:

II - L'oncogène MDM2:

1) MDM2, d'un point de vue structural: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p19-20

2) Les motifs protéiques de MDM2: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p21-22

3) Activité E3 ligase: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p22-23

4) MDM2 est le régulateur principal de p53:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p23-25

5) Fonctions de MDM2 indépendante de p53:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p25-28

a) Contrôle du cycle cellulaire: b) Différenciation cellulaire: c) Régulation transcriptionnelle: d) Réparation de l"ADN: e) Biosynthèse des ribosomes: f) Hypoxie: g) Dégradation des transporteurs: h) Apoptose, et inhibition de croissance:

6) Régulations de la protéine MDM2: . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . p29-32

a) Régulation transcriptionnelle: b) Régulation traductionnelle: c) Régulation post traductionnelle: d) Régulation par localisation subcellulaire:

7) Inhibiteurs pharmacologiques ciblant MDM2: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p32-33

III - MDM4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p34-35

I

IV - Le métabolisme tumoral

1) Glycolyse: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p38-39

2) Voie des pentoses phosphates: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p39-40

3) Métabolisme de la sérine:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p41-46

a) Biosynthèse de novo de sérine: b) Sérine et la famille p53: c) Sérine et pyruvate kinase M2: d) Sérine principale source de glycine: e) Métabolisme un carbone (1C): f) Espoir de traitement:

4) La pyruvate kinase M2: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p46-51

a) Les différentes isoformes de la pyruvate kinase: b) Pyruvate kinase M: gène, structure protéique et fonction c) PKM2 et cancer:

5) Lactate: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p51

6) Cycle de Krebs: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p52-53

7) Glutaminolyse: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p54

V - Activating Transcription Factor:

1) Découverte et nomenclature:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p55

2) ATF3: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p55-57

a) ATF3 et réponse au stress: b) Les fonctions d'ATF3: c) ATF3 et cancer:

3) ATF4: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p58-60

a) localisation, structure et expression: b) Synthèse et dégradation: c) Fonctions biologiques:

VI - Le stress oxydatif:

1) Introduction: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p61

2) ROS et processus physiologiques normaux: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p61

3) ROS et cancer:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p62-64

a) ROS, acteurs de la tumorigenèse: b) Rôle bénéfique potentiel des ROS dans le cancer:

4) Les défenses cellulaires contre les ROS:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p64-67

a) Les systèmes non-enzymatiques: b) Les systèmes enzymatiques:

Objectifs de la thèse: . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p69

Résultats:

Article

Introduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p70

Manuscrit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p71-111

Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p112

Discussion et perspectives:

1) MDM2: bien plus qu'un oncogène, un facteur pronostic: . . . . . . . . . . . .p113-114

2) MDM2 ΔAD: un outil d'étude du métabolisme cancéreux . . . . . . . . . . . . . . p114

3) Quelles kinases candidates pour la régulation allostérique de MDM2 ? . . . p115

J

4) Tous les stress ne mènent pas à la chromatine: . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . p116

5) Oncogènes et suppresseurs de tumeur en première ligne des dérégulation du

métabolisme cellulaire:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p117-118

6) Les voies non étudiées régulées par MDM2: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p119

7) MDM2 régulateur dans la course aux nutriments: . . . . . . . . . . . . . . . p119-121

8) MDM2 participe au contrôle de la transcription : . . . . . . . . . . . . . . . . .p121-122

9) MDM2 régulateur de la sérine: qu'en est il du métabolisme 1C ? . . . . . . .p122

10) La relation entre MDM2 et ATF4:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p123

11) Relevance physiologique de cette relocalisation à la chromatine: . . . p123-125

12) Le complexe MDM2/E4F1: une piste vers la régulation du flux métabolique. . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .p125-126

13) Autre localisation inattendue de MDM2: la mitochondrie. . . . . . . . . . . . . . .p126

14) Les perspectives cliniques : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .p126-127

Bibliographie: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p128-163

K

INDEX DES FIGURES

Figure 1: Hallmarks of cancer.

Figure 2: Le processus multi-étape du cancer.

Figure 3: p53 répond à de nombreux signaux de stress et régule diverses réponses.

Figure 4: Le code p53.

Figure 5: La régulation du métabolisme cellulaire par p53

Figure 6: La structure du gène Mdm2.

Figure 7: Les principaux variants de MDM2.

Figure 8: La structure de la protéine MDM2.

Figure 9: Mode d'action des enzymes qui conduisent à la dégradation protéique. Figure 10: Boucle de rétrocontrôle impliquant p53 et MDM2.

Figure 11: Les différentes fonctions de MDM2.

Figure 12: Les sites de phosphorylation de MDM2.

Figure 13: Les inhibiteurs de MDM2 utilisés en clinique.

Figure 14: La structure de la protéine MDM4.

Figure 15: Vue d'ensemble du métabolisme.

Figure 16: Métabolisme normal vs métabolisme cancéreux.

Figure 17: La glycolyse.

Figure 18: Les principales voies de régulation de la glycolyse.

Figure 19: La voie des pentoses phosphates.

Figure 20: La voie de biosynthèse de la sérine. Figure 21: Adaptation des cellules cancéreuses à une carence en sérine. Figure 22: La disponibilité en sérine module l'activité de PKM2. Figure 23: Biosynthèse et devenir de la glycine. Figure 24: Epissage alternatif du gène Pkm2 et devenir protéique. Figure 25: PKM2: un acteur important de la glycolyse aérobie. Figure 26: Devenir du lactate entre cellules hypoxiques et oxydatives.

Figure 27: Le cycle de Krebs.

Figure 28: La glutaminolyse.

Figure 29: Réponse p53 médiée par les signaux de stress d'ATF3.

Figure 30: L'ARNm d'ATF4.

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