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Exercice n°5 - 1 - NOM : VILLE : Prénom : Note sur : / 40 INTERNAT PHARMACIE EXERCICE N°5 40 POINTS Date : Samedi 21 juillet 2007 & Dimanche 22 juillet 2007

Exercice n°5 - 2 - On souhaite doser chez une patiente la phosphatase alcaline (PAL) sérique selon la méthode recommandée par la SFBC à la température de 30°C : PAL PARA-NITRO-PHENYL-PHOSPHATE PARA-NITRO-PHENOL + PO43- Mg2+ / tampon Sérum PNPP Mg2+ / tampon Volume (µL) 10 200 90 Le PNP est ensuite mesuré par spectrophotométrie à 405 nm (ε = 18,5 cm2.µmol-1). La variation d'absorbance par minute sous un trajet optique de 1 cm est de 0,200. Question 1 : Quel tube de prélèvement doit-on utiliser pour effectuer ce dosage ? Pour quelle raison ? Question 2 : Quelle est la formule semi développée du produit " para-nitro-phénol » ?

Exercice n°5 - 3 -

Exercice n°5 - 4 - Question 3 : Quelle est l'activité du sérum testé en U/L ? Question 4 : Quelle est votre interprétation biologique d'un tel résultat ? Question 5 : Quel examen complémentaire permettrait de l'orienter vers une origine hépatique ?

Exercice n°5 - 5 - ! Les caractéristiques de cette enzyme en présence de son substrat spécifique sont les suivantes : Km = 0,25 x 10-4 mol/L et Vm = 0,33 x 10-6 mol/L/min. Question 6 Représentez la courbe de Lineweaver & Burk [ 1/V = f(1/S) ] à partir des données de l'énoncé : On étudie successivement l'activité de l'enzyme à concentration de substrat constante en présence de deux inhibiteurs sériques différents (A et B) : Concentration de substrat (mol/L) Vitesse en présence de A (mol/L/min) Vitesse en présence de B (mol/L/min) 4 x 10-4 2 x 10-4 1 x 10-4 5 x 10-5 2,5 x 10-5 0,19 x 10-6 0,18 x 10-6 0,16 x 10-6 0,13 x 10-6 0,10 x 10-6 0,30 x 10-6 0,28 x 10-6 0,24 x 10-6 0,19 x 10-6 0,13 x 10-6

Exercice n°5 - 6 -

Exercice n°5 - 7 - Question 7 : Déterminez la nature de l'inhibition provoquée par chacun des inhibiteurs A et B : - en détaillant vos calculs sous forme de tableau - en traçant les courbes décrivant chaque inhibition sur le premier graphe A : B :

Correction exercice n°5 : enzymologie - 1 - CORRECTION INTERNAT PHARMACIE EXERCICE N°5 ENZYMOLOGIE Date : Samedi 21 juillet 2007 & Dimanche 22 juillet 2007

Correction exercice n°5 : enzymologie - 2 - ! On souhaite doser chez une patiente la phosphatase alcaline (PAL) sérique selon la méthode recommandée par la SFBC à la température de 30°C : PAL PARA-NITRO-PHENYL-PHOSPHATE PARA-NITRO-PHENOL + PO43- Mg2+ / tampon Sérum PNPP Mg2+ / tampon Volume (µL) 10 200 90 Le PNP est ensuite mesuré par spectrophotométrie à 405 nm (ε = 18,5 cm2.µmol-1). La variation d'absorbance par minute sous un trajet optique de 1 cm est de 0,200. Question 1 : Quel tube de prélèvement doit-on utiliser pour effectuer ce dosage ? Pour quelle raison ? La mesure d'une activité enzymatique sérique doit être réalisée sur un tube sec (sans anticoagulant) d'autant que la méthode de dosage nécessite la présence de cation divalent de type Mg2+ ce qui proscrit formellement l'utilisation d'anticoagulant de type EDTA qui pourrait chelater ce cofacteur ionique. NB : Le dosage plasmatique est cependant possible mais sur un tube hépariné seulement. Faut-il rappeler la différence entre sérum et plasma à de futurs internes ??? Sérum = sans fibrinogène consommé par coagulation (tube sec) PlasmA = avec fibrinogène donc anticoagulation. Question 2 : Quelle est la formule semi développée du produit " para-nitro-phénol » ?

Correction exercice n°5 : enzymologie - 3 -

Correction exercice n°5 : enzymologie - 4 - Question 3 : Quelle est l'activité du sérum testé en U/L ? Une activité enzymatique correspond à : la quantité de substrat transformée par unité de temps pour un volume donné. Soit : Activité enzymatique par litre de sérum = QPNP / ( Vsérum en µL . 10-6 . dt ) (a) Or : QPNP = CPNP . Vtotal en µL .10-6 (b) Selon la loi de Beer-Lambert : A = ε.CPNP.x A : absorbance ε : coefficient d'extinction molaire (cm2.mol-1) CPNP : concentration molaire de PNP (mol/L) ou (mol/103 cm3) X : trajet optique (cm) Dans l'énoncé, ε est exprimé en " cm2.µmol-1 » La concentration de PNP en mol/L : CPNP = 103. (A / ε.x) (c) (b) et (c) : QPNP = 103. (A / ε.x) . Vtotal en µL .10-6 (d) (a) et (d) : ∆A 1 Vtotal Activité enzymatique = ------ . ---- . --------- . 103 = 0,200 . 1/18,2 . 300/10 . 103 = 324 U/L ∆t ε.x Vsérum Question 4 : Quelle est votre interprétation biologique d'un tel résultat ? Intervalle de référence des PAL à 30°C selon méthode SFBC : [30-100] U/L Les PAL de cette patiente à 324 U/L sont donc nettement élevées. Origine des PAL et causes d'augmentation : - hépatique : cholestase - osseuse : ostéomalacie, tumeurs, rachitismes, fractures, Paget... - placentaire : enceinte ? - intestinale

Correction exercice n°5 : enzymologie - 5 -

Correction exercice n°5 : enzymologie - 6 - Question 5 : Quel examen complémentaire permettrait de l'orienter vers une origine hépatique ? La 5'Nucléotidase est une enzyme spécifiquement hépatique et n'est pas modifiée lors de syndrome osseux. Si les PAL sont augmentées et associées à une augmentation de la 5'Nu, on peut conclure à une origine hépatique dans le cadre d'une cholestase. ! Les caractéristiques de cette enzyme en présence de son substrat spécifique sont les suivantes : Km = 0,25 x 10-4 mol/L et Vm = 0,33 x 10-6 mol/L/min. Question 6 Représentez la courbe de Lineweaver & Burk [ 1/V = f(1/S) ] à partir des données de l'énoncé : 1/V . 106 (mol-1.L.min) - 1 / Km 1/S . 104 (L/mol) 1 / Km = 4 . 104 L / mol 1/ Vm = 3 . 106 L . min / mol 1 / Vm A B

Correction exercice n°5 : enzymologie - 7 -

Correction exercice n°5 : enzymologie - 8 - On étudie successivement l'activité de l'enzyme à concentration de substrat constante en présence de deux inhibiteurs sériques différents (A et B) : Concentration de substrat (mol/L) Vitesse en présence de A (mol/L/min) Vitesse en présence de B (mol/L/min) 4 x 10-4 2 x 10-4 1 x 10-4 5 x 10-5 2,5 x 10-5 0,19 x 10-6 0,18 x 10-6 0,16 x 10-6 0,13 x 10-6 0,10 x 10-6 0,30 x 10-6 0,28 x 10-6 0,24 x 10-6 0,19 x 10-6 0,13 x 10-6 Question 7 : Déterminez la nature de l'inhibition provoquée par chacun des inhibiteurs A et B : - en détaillant vos calculs sous forme de tableau - en traçant les courbes décrivant chaque inhibition sur le premier graphe A : B : 1/S 1/VA 1/VB 0,25 x 104 0,50 x 104 1 x 104 2 x 104 4 x 104 5,3 x 106 5,6 x 106 6,25 x 106 7,5 x 106 10 x 106 3,33 x 106 3,57 x 106 4,17 x 106 5,26 x 106 7,7 x 106 Tableau ci-dessus : calcul de 1/S puis 1/VA et 1/VB A : Modification de Vm mais pas de Km = inhibition NON COMPETITIVE B : Modification de Km mais pas de Vm = inhibition COMPETITIVE