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THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE LA

COMMUNAUTÉ UNIVERSITÉ GRENOBLE ALPES

Spécialité : BIS - Biotechnologie, instrumentation, signal et imagerie pour la biologie, la médecine et l'environnement

Arrêté ministériel : 25 mai 2016

Présentée par

ZINE-EDDINE KHERRAF

Thèse dirigée par Pierre RAY (EDISCE), UGA et CHU de

Grenoble

préparée au sein de l'Institut pour l'Avancée des Biosciences dans l'École Doctorale Ingénierie pour la santé la Cognition et l'Environnement

Exploration génétique et moléculaire de

défauts post-méiotiques sévères de la spermatogenèse entrainant une infertilité masculine. Thèse soutenue publiquement le 12 juillet 2018, devant le jury composé de :

Monsieur Saadi KHOCHBIN

Directeur de Recherche, CNRS Délégation Alpes, Président

Madame Catherine PATRAT

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier, Université Paris 5,

Rapporteur

Monsieur Florian-Jean-Louis GUILLOU

Directeur de Recherche, INRA Centre Val de Loire, Rapporteur

Madame Sophie CHRISTIN-MAITRE

Professeur des Universités - praticien hospitalier, Université Pierre et

Marie Curie, Examinateur

Monsieur Pierre RAY

Professeur des universités - Praticien Hospitalier, Université Grenoble

Alpes, Directeur de thèse

2 3

Résumé

Titre : Exploration génétique et moléculaire de défauts post-méiotiques sévères de la spermatogenèse

entrainant une infertilité masculine.

L'infertilité est considérée actuellement par l'organisation mondiale de la santé (OMS) comme une

préoccupation majeure de santé affectant plus de 50 millions de couples dans le monde. Dans les pays

occidentaux, la majorité des couples infertiles ont recours aux techniques d'assistance médicale à la

procréation (AMP) pour obtenir une grossesse. Malgré le succès de ces techniques, près de la moitié

des couples qui ont recours à l'AMP sortent du parcours de soin sans enfant. Une partie de ces échecs

est expliquée par l'altération de la gamétogenèse. Chez l'homme, la spermatogenèse fait interagir des

centaines de gènes spécifiquement exprimés dans le testicule. L'abondance de ces gènes suggère que

les troubles de la spermatogenèse présentent une forte composante génétique. Récemment, les

avancées techniques ont favorisé l'identification de gènes responsables de ces anomalies mais la

grande majorité des cas d'infertilité masculine reste classée comme idiopathique. L'objectif de la thèse

est d'identifier de nouvelles causes génétiques responsables d'infertilité masculine et d'élucider les

mécanismes physiopathologiques associés à ces anomalies.

Au cours de ma thèse j'ai participé avec l'équipe GETI (génétique, épigénétique et thérapies de

l'infertilité) à l'exploration génétique et moléculaire de deux phénotypes distincts d'anomalies

spermatiques liés à des défauts post-méiotiques de la spermatogenèse : une forme rare d'azoospermie

non obstructive (ANO) et le phénotype d'anomalies morphologiques multiples du flagelle spermatique

(AMMF). Enfin j'ai joué un rôle important dans la création et l'analyse de modèles murins pour

caractériser la pathogénie de ces anomalies.

L'analyse génétique de deux frères infertiles nés de parents consanguins et présentant une ANO

idiopathique associée à un arrêt post-méiotique de la spermatogenèse nous a permis d'identifier un

variant homozygote délétère dans le gène SPINK2 qui code pour un inhibiteur de sérine-protéases.

L'étude des souris KO pour ce gène nous a permis d'observer que les souris mâles adultes sont

infertiles et miment parfaitement les phénotypes spermatique et testiculaire observés chez nos patients.

Nous avons montré que la protéine codée par ce gène est exprimée dans l'acrosome à partir du stade

de spermatide ronde. En l'absence de Spink2, l'activité protéolytique non-neutralisée des protéases

cibles qui transitent par le Golgi cause sa fragmentation et bloque la spermiogénèse au stade de

spermatide ronde. Nous avons également pu observer que les spermatozoïdes provenant de patients et

de souris hétérozygotes présentent un taux élevé d'anomalies morphologiques et une baisse de la

mobilité progressive conduisant à une hypofertilité à expressivité variable. Ces résultats montrent pour

la première fois que l'oligo-tératozoospermie et l'azoospermie peuvent constituer un continuum

pathologique dû à une même pathogénie.

Nous avons également réalisé le séquençage exomique complet d'une cohorte de 78 individus AMMF

non apparentés et avons identifié chez 49 sujets des mutations bi-alléliques délétères dans 11 gènes

candidats dont DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 et FSIP2, soit un rendement diagnostique de

63%. Ces résultats confirment l'hétérogénéité génétique du phénotype MMAF et l'efficacité

diagnostique du séquençage haut débit dans son exploration. Nous avons également validé

l'implication de certains gènes candidats (n=4) dans ce phénotype chez le modèle murin knock-out

créé par la nouvelle technologie d'édition du génome, CRISPR/Cas9.

Dans son ensemble, ce travail montre l'intérêt et l'efficacité de la combinaison du séquençage

exomique et de la technique de CRISPR/Cas9 pour étudier les troubles de la spermatogenèse et

l'infertilité masculine.

Mots clés : Infertilité, spermatogenèse, azoospermie, flagelle spermatique, séquençage exomique,

CRISPR/Cas9.

4 5

Abstract

Title: Genetic and molecular exploration of severe post-meiotic defects of spermatogenesis leading to

male infertility. Infertility is currently considered by the World Health Organization (WHO) as a major health concern

affecting more than 50 million couples worldwide. In western countries, the majority of infertile

couples seek assisted reproductive technologies (ART) to achieve a pregnancy. Despite the success of

these techniques, almost half of these couples fail to obtain a child. Part of these failures are explained

by the alteration of gametogenesis. In humans, spermatogenesis involves hundreds of genes

specifically expressed in the testis. The abundance of these genes suggests that spermatogenic defects

are associated with a strong genetic component. Recently, technical advances have led to the

identification of numerous causative genes, but the vast majority of male infertility cases remain

idiopathic. The aim of the present thesis is to identify new genetic causes responsible for male

infertility and to elucidate the physiopathological mechanisms associated with these anomalies.

During my thesis, I participated with the team GETI (genetics, epigenetics and therapies of infertility)

in the genetic exploration of two phenotypes of male infertility related to post-meiotic defects of spermatogenesis: a rare form of non-obstructive azoospermia and the phenotype of multiple morphological abnormalities of the sperm flagella (MMAF). I have also played a key role in creation

and analysis of transgenic mice to better characterize the pathogeny of the identified genetic causes in

Human.

Genetic analyses performed on two infertile brothers born form consanguineous parents and

presenting an-idiopathic non-obstructive azoospermia associated with a post-meiotic arrest of

spermatogenesis allowed us to identify a homozygous variant in the SPINK2 gene that encodes a

serine-protease inhibitor. Phenotypic analysis of Spink2-/- adult male mice showed that they are

infertile and perfectly mimic the sperm and testicular phenotypes observed in our patients. We showed

that Spink2 protein is expressed from the round spermatid stage and localized in the acrosome, a

lysosomal-like vesicle rich in proteases that play a key role during fertilization. When Spink2 is

absent, the deregulated proteolytic activity of the targeted proteases such as acrosin leads to the

fragmentation of the Golgi apparatus and arrest of spermiogenesis at the round spermatid stage. We also showed that sperm from heterozygous human and mice present a high level of morphological

abnormalities and a decrease of progressive motility leading to a variable subfertility. These results

showed for the first time that oligo-teratozoospermia and azoospermia could present a pathological continuum due to the same pathogeny. We also performed exome sequencing in a cohort of 78 non related MMAF subjects and identified in

49 cases deleterious bi-allelic mutations in a total of 11 candidate genes including DNAH1, CFAP43,

CFAP44, WDR66 and FSIP2 giving a genetic diagnosis yield of 63%. These results confirm the genetic heterogeneity of MMAF and the efficiency of high throughput sequencing in genetic exploration of this phenotype. We also demonstrated the pathogenic implication of certain candidate genes (n=4) using knock-out mice created by the new technology of genome editing, CRISPR/Cas9. Overall, this work demonstrates the interest and effectiveness of combining exome sequencing and CRISPR/Cas9 system to study spermatogenesis disorders and male infertility. Keywords: Infertility, spermatogenesis, azoospermia, sperm flagellum, exome sequencing,

CRISPR/Cas9.

6 7 Je dédie cette thèse à mes parents Mounira et l'Hbib et à mon épouse Ismahane 8

REMERCIEMENTS

Je remercie Madame le Professeur Catherine PATRAT et Monsieur le Docteur Florian GUILLOU pour le temps qu'ils ont accepté de me consacrer afin d'évaluer mon travail de thèse et pour le rapport qu'ils en ont fait. Je remercie Madame le Professeur Sophie CHRISTIN-MAITRE et Monsieur le docteur Saadi KHOCHBIN d'avoir accepté de participer à mon jury et de juger ce travail. Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance envers le Professeur Pierre RAY pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et dirigé avec enthousiasme ces travaux, pour ses nombreux conseils, pour sa bonne humeur et pour sa disponibilité. Merci de recevoir mes remerciements les plus chaleureux. Je remercie naturellement toutes les personnes de l'équipe GETI. Je remercie particulièrement le Docteur Christophe ARNOULT, le Professeur Serge BOTTARI et le professeur Charles COUTTON pour le coeur mis dans chacune de nos discussions et pour tout le savoir qu'ils ont su me transmettre avec passion. De tout mon coeur, je remercie Madame Anne GUERIN-DUGUE, la directrice de l'école doctorale et son assistante, Madame Orélie GARZENA pour leur disponibilité, compréhension et gentillesse. Je tiens également à remercier la direction de l'INSERM pour m'avoir sélectionné pour un

poste d'accueil pour hospitaliers. La qualité de ce travail dépend fortement de ce poste et j'en

suis très reconnaissant.

A toutes les personnes de l'Institut pour l'avancée des biosciences et en particulier au

Professeur Pierre HAINAUT et son assistante Amélie FAUCONNET. Merci de m'avoir aidé dans mes démarches administratives. Au doyen de la faculté de médecine Monsieur le Professeur Patrice MORAND et tous les membres de la commission recherche du CHUGA. Au professeur Patrice FAURE, pour son accueil et intégration au sein de son département à l'IBP et à toutes les personnes exerçant au sein des UM de BGM et de GI-DPI.

9A tous mes amis qui m'ont soutenu ces dernières années, mais qui sont trop nombreux pour les citer tous ici... J'exprime toute ma gratitude à mes parents L'Hbib et Mounira, mes frères Mohamed, Sif et

Adam ainsi que tout le reste de ma grande famille... Je conclurai en remerciant de tout mon coeur mon épouse Ismahane pour son aide et son soutien inconditionnels et mes enfants Kays, Soujoud et Yassine qui illuminent ma vie chaque jour.

Merci infiniment...

10 11

TABLE DES MATIERES

LISTE DES FIGURES ........................................................................................................................ 15

LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................... 16

LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................................ 17

PREFACE ............................................................................................................................................ 19

PARTIE 1: ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................... 21

Chapitre I. Aspects physiologiques et moléculaires de la fertilité masculine ......................... 23

1- Rappel : l'appareil de reproduction masculin ........................................................................ 23

2- Rôle des principales glandes annexes .................................................................................... 24

2.1- Les vésicules séminales ................................................................................................. 24

2.2- La prostate ..................................................................................................................... 24

3- Anatomie du testicule ............................................................................................................ 25

4- L'organogenèse gonadique et la différenciation testiculaire ................................................. 26

4.1- La formation des crêtes génitales .................................................................................. 26

4.2- Le développement des cellules germinales primordiales .............................................. 26

4.3- La différenciation masculine de la gonade bipotentielle ............................................... 28

4.4- La descente des testicules .............................................................................................. 30

5- Description générale de la spermatogenèse ........................................................................... 30

6- Les cellules somatiques de Sertoli ......................................................................................... 34

6.1.1- Description morphologique et fonctionnelle ......................................................... 34

6.1.2- La barrière hémato-testiculaire .............................................................................. 35

7- Maturation et différenciation des cellules germinales ........................................................... 36

7.1- Les cellules germinales souches et les spermatogonies ................................................. 36

7.2- La méiose ou division réductionnelle ............................................................................ 38

7.2.1- Les spermatocytes primaires et la méiose I ........................................................... 38

7.2.2- Les spermatocytes secondaires et la méiose II ...................................................... 40

7.3- La spermiogénèse .......................................................................................................... 40

7.3.1- Biogenèse de l'acrosome ....................................................................................... 40

7.3.2- Hypercompaction de la chromatine ....................................................................... 45

7.3.3- Formation du flagelle ............................................................................................ 47

7.3.3.1- L'axonème.......................................................................................................... 48

A. Les dynéines axonémales ...................................................................................... 48

B. Les ponts radiaires ................................................................................................. 50

C. Le CSC et le N-DRC ............................................................................................. 52

D. Le complexe central .............................................................................................. 54

7.3.3.2- Les structures para-axonémales.......................................................................... 55

8- La spermiation ....................................................................................................................... 57

9- La maturation épididymaire des spermatozoïdes .................................................................. 59

10- La régulation hormonale de la spermatogenèse ................................................................ 60

Chapitre II. L'infertilité masculine ......................................................................................... 64

1- Définition et données épidémiologiques ............................................................................... 64

2- Les facteurs pré-testiculaires associés à l'infertilité masculine ............................................. 65

2.1- L'hypogonadisme hypogonadotrope ............................................................................. 65

122.2- L'hyperprolactinémie .................................................................................................... 65 2.3- Rôle des perturbateurs endocriniens .............................................................................. 66

3- Les facteurs testiculaires associés à l'infertilité masculine ................................................... 66

3.1- La varicocèle ................................................................................................................. 66

3.2- Le cryptorchidisme ........................................................................................................ 67

3.3- Les facteurs génétiques .................................................................................................. 67

3.3.1- L'azoospermie non-obstructive ............................................................................. 67

3.3.1.1- Le syndrome de Klinefelter ................................................................................ 68

3.3.1.2- Les microdélétions sur le bras long du chromosome Y ..................................... 69

3.3.2- Les tératozoospermies monomorphes ................................................................... 70

3.3.2.1- La macrozoospermie : les spermatozoïdes macrocéphales multi-flagellés ........ 70

3.3.2.2- La globozoospermie : les spermatozoïdes microcéphaliques ............................. 73

3.3.2.3- L'asthénozoospermie et le phénotype MMAF ................................................... 76

4- Les infertilités obstructives.................................................................................................... 78

4.1- L'absence bilatérale des canaux déférents (ABCD) ...................................................... 78

4.1.1- Le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) .................................... 78

4.1.2- Le gène ADGRG2 (adhesion G protein-coupled receptor G2) ............................. 80

4.2- Le syndrome de Young ................................................................................................. 81

4.3- Les obstructions post-infectieuses et iatrogènes ............................................................ 81

Chapitre III. Les investigations cliniques et paracliniques de l'infertilité masculine .......... 82

1- L'examen clinique ................................................................................................................. 82

2- L'analyse du sperme .............................................................................................................. 82

2.1- Le spermogramme ......................................................................................................... 82

2.1.1- Le spermocytogramme .......................................................................................... 84

2.2- Le dosage des biomarqueurs séminaux ......................................................................... 85

3- L'exploration hormonale de l'axe gonadotrope .................................................................... 85

4- Les investigations génétiques de routine ............................................................................... 85

4.1- Identification de nouveaux gènes candidats par le séquençage exomique .................... 86

4.1.1- Introduction ........................................................................................................... 86

4.1.2- Principes du séquençage et étapes de l'analyse bio-informatique des données .... 87

4.1.2.1- Rappel : le séquençage conventionnel de Sanger ............................................... 88

4.1.2.2- Le séquençage exomique.................................................................................... 88

E. La préparation de l'ADN ....................................................................................... 88

F. L'enrichissement ................................................................................................... 89

G. L'amplification et la réaction de séquence ............................................................ 89

4.1.2.3- L'analyse bio-informatique ................................................................................ 89

H. Objectifs et principes ............................................................................................. 89

I. Cas particulier : détection des variants de nombre de copies (CNVs, copy number

variants) ......................................................................................................................... 91

4.2- Validation des gènes candidats chez le modèle murin CRISPR/Cas9 .......................... 92

4.2.1- Introduction ........................................................................................................... 92

4.2.2- Historique de la transgénèse murine ...................................................................... 92

4.2.3- Le système CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 93

4.2.4- Article 1 : Creation of knock out and knock in mice by CRISPR/Cas9 to validate

candidate genes for human male infertility, interest, difficulties and feasibility ................... 95

Chapitre IV. Les techniques d'Assistance Médicale à la Procréation (AMP) .................... 112

1.1- L'Insémination Artificielle (IA) .................................................................................. 113

131.2- La Fécondation In Vitro (FIV) .................................................................................... 113

1.2.1- La stimulation ovarienne ..................................................................................... 113

1.2.2- Le recueil des gamètes ......................................................................................... 113

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