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Ministère de l·Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université HassibaBenboualide Chlef

Faculté Des Sciences de la Nature et de la vie

Département de Biotechnologie

Module : Bio-analyse et Bio-informatique

L 3 Biotchnologievégétale et Amélioration , semestre 1 , 2021/2022 Cours réalisé par : Mr CHELGHAM AbdelHakim

Le but de ce module :

Initier les étudiants à la bio-informatique en leur faisant découvrir les connaissances ,les techniques et les outils utilisés dans cette discipline .

Prérequis recommandés :

Biologie moléculaire , génie génétique ,

Informatique , Analyses de laboratoire ,

Bio-statistiques

Contenu du module :

‰Introduction à la Bio-informatique

‰Initiation à l·outil informatique

‰Chapitre 1 : Méthodes d·analyse moléculaire ‰Chapitre 2 : Banques et Bases de données en Biologie

‰Chapitre 3 : Alignement des séquences

Domaines protéiques

Annotation des génomes

Introduction

Introduction à la Bio-informatique :

C·est quoi la Bio-informatique ?

Introduction à la Bio-informatique :

-La bio-informatique est une " interdiscipline» à la frontière de labiologie, de l·informatiqueet des mathématiques.

Introduction à la Bio-informatique :

Définition de La bio-informatique :

est une sous-discipline de la biologie et de l'informatique concernée par l'acquisition, le stockage , l'analyseet la diffusion de données biologiques, le plus souvent des séquences d'ADN et ARN et d'acides aminés.

Données biologiques :

Introduction à la Bio-informatique :

Introduction à la Bio-informatique :

Donnés biologiques = Bio-information

La Bioinformationest l'information liée aux molécules biologiques (ADN / ARN / Proteins). les types de bio-information on distingue :

1) La séquence

2) le nombre des molécules biologiques

3) Structure de la molécule biologique

4) La fonction de la molécule biologique

5 ) les interactions des molécules biologiques ...

Introduction à la Bio-informatique :

Donnés biologiques = Bio-information

La Bioinformationest l'information liée aux molécules biologiques (ADN / ARN / Proteins) , on distingue :

1 ) la séquence

Les séquences constituent l'un des principaux types de bioinformationqu'analyse la bioinformatique. comment s·effectue l·obtention de ses séquence !! C·est ce qu·on va voir dans le chapitre 1

Introduction à la Bio-informatique :

Pourquoi la Bio-informatique !

Introduction à la Bio-informatique :

Introduction à la Bio-informatique :

Pourquoi la Bio-informatique !

Introduction à la Bio-informatique :

Introduction à la Bio-informatique :

Les ordinateurs sont composés de :

‡ une unité centrale (UC )

‡ d'un dispositif d'affichage ( carte graphique + écran ), ‡ d'un système Entrés/sorties (clavier + souris), ‡ de moyens de stockage (disques magnétiques, CD, DVD"), ‡ de dispositifs de communications (cartes réseau, modem) ‡ et + de divers périphériques (imprimantes , scanner,") Un certain nombre de ces composants sont insérés sur une carte principale ou carte mère .

Initiation à l·outil Informatique

La principale composante de l·unité centrale (UC) : La carte mère : elle se trouve au centre de l'ordinateur et connecte tous les composants de l'ordinateur. La carte mère contient les connexions pour le processeur, la mémoire, les unités de stockage... Elle intègre une carte son et une carte graphique.

Initiation à l·outil Informatique :

Le processeurC'est le cerveau de l'ordinateur. Il réalise tous les calculs nécessaires au fonctionnement de l'ordinateur. la RAMou mémoire temporaire de l'ordinateur stockent les fichiers sur lesquels l'utilisateur est en train de travailler. Elle est temporaire, car les informations sont supprimées lors de l'arrêt de l'ordinateur. Disque dur stocker des informations: documents, photos".

Initiation à l·outil Informatique :

Chapitre 1 :

méthodes d·analyse moléculaire Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire Les méthodes d·analyse moléculaire permettent l'obtention des séquences (séquence des nucléotides·ADN· ou séquence Protéiques) par la technique de séquençage. Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Introduction au séquençage :

Le génome : Ensemble du matériel génétique, c'est-à-dire des molécules d'A.D.N, d'une cellule. Le génome est contenu dans le noyau et les mitochondries (génome mithochondriale) et dans le chloroplastes (génome chloroplastique). Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Introduction au séquençage :

Le génome est le responsable des caractéristique d·un être vivant Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Introduction au séquençage :

ADN Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Introduction au séquençage :

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Introduction au séquençage :

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Introduction au séquençage :

Les méthodes d·analyse moléculaire permettent l'obtention des séquences (séquence des nucléotides·ADN· ou séquence Protéiques) par la technique de séquençage Définition de séquençage : la détermination de la succession des nucléotides (ADN/ARN) ou des

Acides aminés (le cas des proteines) .

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire Définition du séquençage de l·ADN : est la détermination de la succession des nucléotides le composant. ÎUne technique de routine pour les laboratoires . Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire Définition du séquençage de l·ADN : est la détermination de la succession des nucléotides le composant. ÎSéquençage de tous les gènes codants : séquençage de l·exome. ÎSéquençage degénome entier : séquençage du génome. Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire Historiquedu séquençage des acides nucléiques et séquençage Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire Historiquedu séquençage des acides nucléiques et séquençage Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

Méthode de Sanger (1975)

Méthode Maxam²Gilbert (1977)

Automatisation de Sanger (de ~1980 à 2005)

Nouvelles Générations de Séquenceurs (depuis 2005) NGS : NextGenerationSequencing(désormais largement utilisés)

NNGS : Next-Next Generation Sequencing (encours):

en particulier technologie SMS (Single MoleculeSequencing) Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Avancée

technique de séquençage

Le coût

Les méthodes de séquencage:

chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquencage:

1)Méthode de Sanger :

dite aussi méthode parterminaison de chaîne

Frederick SANGER (1918-2013).

Biochimiste anglais qui a reçu 2 prix Nobel de

chimie ÎC·est une méthode de séquençage de l'ADN parsynthèse enzymatique.

Principe de la méthode:

Polymérisation avec ADN polymérase à partir d·une amorce synthétique radiomarquée, en présence des désoxyribonucléotides"4 dNTPs» , et d·une quantité limitée des didésoxyribonucléotides"ddNTP» (terminateur de chaîne). Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

1)Méthode de Sanger :

Les procédures de séquençage par la méthode de Sanger

‡ Purificationde l·ADN

génomique par une PAGE

Fragmentationde l·ADN

‡ Clonagede fragment d·ADN

a séquencé dans un vecteur (plasmide ..)

‡ L·hybridationavec amorce

synthétique complémentaire au primer du vecteur marquées radioactivementen

5·.

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

1)Méthode de Sanger :

Les procédures de séquençage par la méthode de Sanger Puis il faut préparer4solutions contenant chacune :

²Le fragment qui doit être séquencé

²L·amorce car la polymérase nécessite un court fragment complémentaire du brin à séquencer pour initier la synthèse du brin copie. ²Les 4 dNTP's(dNTPsignifie Nucléotide) : dCTP, dATP, dGTPet dTTP.

²L'ADN polymérase

-Dans chaque tube, on met aussi de petite quantité d'un ddNTP radioactif (32P) . L·incorporation aléatoire d·un ddNTPstoppe la synthèse de brin d·ADN . Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquencage:

1)Méthode de Sanger :

Les procédures de séquençage par la méthode de Sanger

Pourquoi le DDNTP stoppe la synthèse ?

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquencage:

1)Méthode de Sanger :

Les procédures de séquençage par la méthode de Sanger Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

1) Méthode de Sanger :

L'allongement du brin d'ADN s'arrête donc au niveau duddNTPincorporé, d'où terminaison de la synthèse de l'ADN . Synthèse du brin complémentaire et si arrêt par un ddNTPalors il y a une Ndans la séquence .

N = A ou G ou T ou C

-A la fin des réactions, des copies d'ADN de tailles variées ont été obtenues, selon l'endroit de l·insertion de ddNTP. Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

1)Méthode de Sanger :

Puis l·étape finale : Electrophorèse migration sur 4 colonnes ƒSéparation des copies selon leur taille par une migration électrophorétique dans un gel poreux ƒCesgels permettent de séparerdeux copies qui ont une différence de taille d'un seulnucléotide Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

1)Méthode de Sanger :

Avantages :

‡ Méthode basée sur la polymérisation n·exige pas de purification de matrices d·ADN. ‡ La taille de la lecture est relativement grande (800 nucléotides).

Inconvénients :

‡ Lecture du brin complémentaire de la séquence analysée.

‡ Les hybridations parasites (faux positifs).

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

1)Méthode de Sanger :

Le résumé de la méthode

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

2) La technique de séquençage avec desdidésoxyribonucléotides

fluorescentsou " dyeterminatorsequencing» Utilise des didésoxyribonucléotidesdont chacun est marqué par un fluorophorespécifique .

Exemple de ddNTPfluorescents:

6-TAMRA-ddATP fluorescent vert

6-FAM-ddTTP fluorescent rouge

5-TET-ddCTP fluorescent bleu

5-HEX-deaza-ddGTP fluorescent jaune

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire " dyeterminatorsequencing» Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

2) La technique de séquençage avec desdidésoxyribonucléotides

fluorescentsou " dyeterminatorsequencing» : Améliorations apportées par rapport à la méthode de Sanger :

1)La méthode de Sanger est coûteuse (4 réactions

distinctes) et dangereuse (radioactivité) . cette méthode ( 1 réaction )

2) Eviter la formation de "faux-stop": la terminaison

prématurée d'une copie qui implique un dNTPà la place d'un ddNTP. Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

3) La technique de séquençage de Maxamet Gilbert :

Cette méthode nécessite des réactifs chimiques toxiques et reste limitée quant à la taille des fragments d'ADN qu'elle permet d'analyser (< 250 nucléotides). Moins facile à robotiser, son usage est devenu aujourd'hui confidentiel. Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

4) Séquençage De Génome Entier par la Méthode aléatoire

global : Principe : Fragmentation du génome en un grand nombre de fragments de petite Taille (2 -3 kb) , qui sont séquencés puis alignés . ‡ Utilisée aujourd·hui pour tous les génomes bactériens

‡ Rapide et économique

Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

4) Séquençage De Génome Entier par méthode aléatoire global

Les démarches :

‡ Fractionnement du genome(plusieurs copies) en un grand nombre de fragments de petit taille (qqmilliers de pb). ‡ Séquençage des extrémités d·une partie de ces fragments (un nombre de séquençage de profondeur de 10x pour les grands génomes). ‡ Assemblage des lectures chevauchantes par des programmes informatiques (formation des contigs). ‡ Assemblage des contigs et comblement des trous ( grâce à des logiciels informatiques). NB : Contig = un ensemble de fragments qui sont relies entre eux par des recouvrements de sequencesidentiques Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

4) Séquençage De Génome Entier :

Méthode aléatoire global (whole-genomeshotgun)

Les démarches :

‡Fractionnement du genome(plusieurs copies) en un grand nombre de fragments de petit taille (qqmilliers de pb). ‡Séquençage des extrémités d·une partie de ces fragments (un nombre de séquençage de profondeur de 10x pour les grands génomes). ‡Assemblage des lectures chevauchantes par des programmes informatiques (formation des contigs). ‡Assemblage des contigs et comblement des trous ( grâce à des logiciels informatiques). NB : Contig = un ensemble de fragments qui sont relies entre eux par des recouvrements de sequencesidentiques Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire

Les méthodes de séquençage :

4) Séquençage De Génome Entier :

Méthode aléatoire global (whole-genomeshotgun)

Les démarches :

‡Fractionnement du genome(plusieurs copies) en un grand nombre de fragments de petit taille (qqmilliers de pb). ‡Séquençage des extrémités d·une partie de ces fragments (un nombre de séquençage de profondeur de 10x pour les grands génomes). ‡Assemblage des lectures chevauchantes par des programmes informatiques (formation des contigs). ‡Assemblage des contigs et comblement des trous ( grâce à des logiciels informatiques). NB : Contig = un ensemble de fragments qui sont relies entre eux par des recouvrements de sequencesidentiques Chapitre 1 : méthodes d·analyse moléculaire Séquençage des acides aminés dans un peptide :quotesdbs_dbs27.pdfusesText_33

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