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Université de Montréal
ParAurélien Colamartino
Département de Microbiologie, Immunologie et infectiologie, Faculté de médecineEn Microbiologie et Immunologie
Mai 2020
© Aurélien Colamartino, 2020
Université de Montréal
Unité académique : département de Microbiologie, Immunologie et Infectiologie, Faculté de
Médecine
Cette thèse intitulée
Présenté par
Aurélien Colamartino
A été évaluée par un jury composé des personnes suivantesJean-Sébastien Delisle
Président-rapporteur
Elie Haddad
Directeur de recherche
Denis-Claude Roy
Membre du jury
Yannick Doyon
Examinateur externe
Résumé
résistants, a ouvert la voie à la thérapie cellulaire et génique dans ce contexte. Malgré les premiers
hématopoïétiques (HSC) permettrait de dépasser les limites de la thérapie CAR utilisant les cellules
permet une transduction efficace des NK avec un vecteur lentiviral. Par cette méthode nous avonspu générer de grandes quantités de cellules NK transduites avec un CAR, prouvant la possibilité
de produire des cellules CAR T en permanence pour renouveler les cellules T épuisées. Cependant,
que les cellules T dans la thérapie CAR.Mots-clés : Immunothérapie, Leucémie, cellule NK, Cellule souche hématopoïétique,
Transduction, Promoteur spécifique, Cancer, Cellule T.Abstract
Immunotherapy has allowed major advances in cancer therapy. The treatment using modified T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) completely changed the vision of leukemia therapy. The efficiency against resistant cancer paved the way to cellular and gene therapy in this context. Despite very positive results at first, the disappearance and exhaustion of therapeutic cells seems to be a major problem to maintain the efficiency of the CAR treatment and prevent relapses. Thework of this thesis is to allow the use cell types other than T cells for CAR therapy. The hypothesis
is that NK cells or hematopoietic stem cells (HSC) could overcome the limitation of CAR therapy using T cells. To allow the use of CAR NK cells, a major technical issue is the transduction by viral vectors. The work presented here shows the use of BaEV envelope to pseudotype vectors allows an efficient transduction of NK cells. Using this method, we were able to produce large amounts of CAR NK cells, showing the possibility to use NK cells in CAR therapy. The use of HSC in CAR therapy, could allow the permanent replenishment of the pool of CAR T cells once exhausted. Despite that advantage, the overexpression of a CAR receptor on all hematopoietic cells coming from those HSC could be an issue. To allow the use of HSC, we developed short specificpromoters restraining the expression of the transgene to a precise population. We prove the
specificity of a T cell promoter and demonstrated the possibility to use it in CAR therapy using HSC. This work is a proof of concept of the use of other population than T cells in CAR therapy. Keywords : Immunotherapy, Leukemia, NK cell, Hematopoiteic Stem Cell, Transduction, SpecificPromoter, Cancer, T Cell.
Table des matières
Résumé ............................................................................................................................................. 5
Abstract ............................................................................................................................................ 7
Table des matières ............................................................................................................................ 9
Liste des tableaux ........................................................................................................................... 15
Liste des figures ............................................................................................................................. 17
Liste des sigles et abréviations ....................................................................................................... 19
Remerciements ............................................................................................................................... 27
Chapitre 1 ± Introduction ............................................................................................................... 31
1. La Leucémie ....................................................................................................................... 31
1.1.1. Les mutations initiatrices ...................................................................................... 32
1.1.2. Amplification des clones initiateurs ..................................................................... 32
1.1.3. Mécanismes cellulaires anti-cancéreux ................................................................ 35
1.2. La Leucémie ................................................................................................................. 37
1.2.2. Prévalence et facteurs de risque ............................................................................ 38
1.3. Les traitements de la leucémie ..................................................................................... 39
1.3.1. Les effets secondaires ........................................................................................... 40
2. Le système immunitaire face au cancer ............................................................................. 41
2.1. Les cellules Natural Killer (NK) .................................................................................. 42
2.1.1. Le développement des cellules NK ...................................................................... 42
2.1.2. Signalisation NK ................................................................................................... 44
102.1.2.1. Les signaux activateurs ................................................................................... 44
2.1.2.2. Les signaux inhibiteurs ................................................................................... 45
2.1.3. Les mécanismes de cytotoxicité ........................................................................... 46
2.1.3.1. La dégranulation ............................................................................................. 47
2.1.3.2. Les récepteurs de mort .................................................................................... 49
2.2. Les cellules T ............................................................................................................... 51
2.2.1. Le développement des cellules T .......................................................................... 51
2.2.1.1. Développement dans la moelle ....................................................................... 51
2.2.1.2. Sélection thymique et recombinaison du TCR ............................................... 52
2.2.2. La fonction des cellules T ..................................................................................... 54
2.3.1. La régulation du MHC .......................................................................................... 57
2.3.2. La perte de ligands activateurs ............................................................................. 58
2.3.3. La sécrétion de cytokines...................................................................................... 59
2.3.5. Blocage des interactions et de la formation de la synapse.................................... 61
3.1. La greffe de cellules moelle osseuse ou greffe de HSC ............................................... 63
3.1.1. Les NK dans la greffe de moelle .......................................................................... 63
3.1.2. Les T dans la greffe de moelle .............................................................................. 64
3.1.3. Les désavantages de la greffe de moelle............................................................... 65
113.2. Les traitements cytokiniques ........................................................................................ 66
3.3. Les bloqueurs de récepteurs inhibiteurs ....................................................................... 69
3.3.2. Les anti-PD1 et anti-PDL1 ................................................................................... 71
3.3.3. Les limites des inhibiteurs de point de contrôle ................................................... 71
3.4. Les anticorps monoclonaux ciblant le cancer .............................................................. 73
3.4.2. Les BiKE et TriKE (Bispecific et Trispecific Killer cell Engager) ...................... 74
3.5.1. La structure des CAR ........................................................................................... 76
3.5.2. Le scFv et la problématique de la cible ................................................................ 78
3.5.2.1. Toxicité selon la cible ..................................................................................... 78
3.5.3. La charnière et le segment transmembranaire ...................................................... 81
3.5.4. Les segments internes et la signalisation .............................................................. 82
3.5.5. Le succès clinique des CAR ................................................................................. 84
3.5.6. Les problèmes des CAR ....................................................................................... 84
3.5.6.1. La toxicité de la thérapie CAR ....................................................................... 84
3.5.6.3. La difficulté de production des cellules thérapeutiques ................................. 86
12 tonique 874. Hypothèse et objectifs ........................................................................................................ 91
4.1. Hypothèse .................................................................................................................... 93
4.2. Objectifs ....................................................................................................................... 93
Chapitre 2 ± Premier article............................................................................................................ 95
1. Introduction du premier article ........................................................................................... 95
2. Premier article .................................................................................................................... 96
2.1. Figure 1 ...................................................................................................................... 114
2.2. Figure 2 ...................................................................................................................... 115
2.3. Figure 3 ...................................................................................................................... 116
Chapitre 3 ± Brevet ...................................................................................................................... 119
Chapitre 4 ± Deuxième article ...................................................................................................... 121
1. Introduction du deuxième article ...................................................................................... 121
2. Deuxième article............................................................................................................... 122
2.1. Tableau ....................................................................................................................... 140
2.2. Figures ........................................................................................................................ 142
2.2.1. Figure 1 ............................................................................................................... 146
2.2.2. Figure 2 ............................................................................................................... 147
2.2.3. Figure 3 ............................................................................................................... 148
2.2.4. Figure 4 ............................................................................................................... 149
2.2.5. Figure 5 ............................................................................................................... 150
2.2.6. Figure 6 ............................................................................................................... 151
132.2.7. Figure 7 ............................................................................................................... 152
2.2.8. Figure S1 ............................................................................................................. 153
2.2.9. Figure S2 ............................................................................................................. 154
2.2.10. Figure S3 ......................................................................................................... 155
2.2.11. Figure S4 ......................................................................................................... 156
Chapitre 5 ± Discussion et Perspectives ....................................................................................... 157
3. Analyse et implications des résultats................................................................................ 157
3.1. La transduction des NK et la thérapie CAR ............................................................... 157
3.1.2. Optimisation des CAR pour les NK ................................................................... 159
1.1.2.1 Utilisation de segments de récepteurs NK ....................................................... 159
1.1.2.2. Utilisation de segments de récepteurs aux cytokines ...................................... 159
3.2. La génération de nouveaux promoteurs spécifiques .................................................. 161
3.2.1. La génération de promoteurs basés sur les enhancers déterminés par CAGE .... 161
3.2.2. Les utilisations des promoteurs spécifiques ....................................................... 162
3.3.1. Les avantages et inconvénients des HSC dans la thérapie CAR ........................ 163
3.3.2. Les HSC dans la thérapie CAR, un casse-tête immunitaire ............................... 168
3.3.2.1. Le signal tonique pendant la différenciation ................................................ 169
3.3.2.2. La liaison du CAR avec les cellules B dans le thymus................................. 169
3.3.2.3. Une tolérance du signal CAR ? .................................................................... 171
144. Futur de la thérapie CAR ................................................................................................. 175
4.1.1. Combinaison avec les inhibiteurs de point de contrôle ...................................... 175
4.1.2. Combinaison avec les cytokines ......................................................................... 176
4.1.3. Les CAR " en armure » ...................................................................................... 176
4.1.4. Les combinaisons de CAR ................................................................................. 177
4.1.4.1. Deux CAR pour une même cellule ............................................................... 177
4.1.4.2. Un CAR pour deux cellules différentes ........................................................ 178
4.2. Traitement des cancers solides ................................................................................... 179
4.2.1. Le problème de persistance ................................................................................ 179
4.2.2. Les cibles pour les tumeurs solides .................................................................... 180
4.2.2.1. EGFR et EGFRvIII ....................................................................................... 181
4.2.2.2. Le GD2 pour le neuroblastome..................................................................... 181
4.3. La découverte de nouvelles cibles ............................................................................. 183
4.3.1. Le séquençage pour déterminer de nouvelles cibles........................................... 184
4.3.3. Approches expérimentales de découverte de cible ............................................. 185
Chapitre 6 ± Conclusion ............................................................................................................... 189
Références bibliographiques ........................................................................................................ 191
Annexes ........................................................................................................................................ 237
Liste des tableaux
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