[PDF] Régulation de lexpression de la mucine MUC4 par les miARN et

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2MiB}+ `2b2`+? /Q+mK2Mib- r?2i?2` i?2v `2 Tm#@

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JûHMB2 o2`M2`2i

hQ +Bi2 i?Bb p2`bBQM, JûHMB2 o2`M2`2iX _2+QMMBbbM+2 2i T?;Q+viQb2 /2b +2HHmH2b TQTiQiB[m2b ô_¬H2 /2 *R[ 2i /2 H i2H@yRyee9k3 Université Joseph Fourier / Université Pierre Mendès France /

Pour obtenir le grade de

SpécialitéImmunologie, Biologie cellulaire

Arrêté ministériel

Présentée par

Mélanie VERNERET

Thèse dirigée par Philippe FRACHET

Jean

Institut de Biologie Structurale

l'École Doctorale de

RECONNAISSANCE ET

Thèse soutenue pu

19 Septembre 2012,

Mr, Professeur, CHU/EFS Grenoble, Président du Jury

Professeur, Université de Lyon, Rapporteur

Mr,

Chercheur, CEA Saclay,

Chercheur INSERM, Lyon, Examinateur

Mr Maître de conférences, Grenoble, Directeur de thèse Mr

Chercheur, CEA Grenoble, Co

3

Remerciements

chaleureusement le Pr Christian DROUET d'avoir ac jury mais Ġgalement de m'aǀoir suiǀie s ont toujours ĠtĠ d'une grande aide pour la remercie également le pour l'edžamen attentif de mon traǀail. toujours plus loin dans la réalisation de mes travaux, idées et objectifs. J'adresse Ġgalement ma sincğre reconnaissance au Dr Anne

Ce traǀail est aussi et bien sur le fruit de rencontres et d'Ġchanges multiples, scientifiques et

CEA). ă l'IAB pour son edžpertise lors

des expériences de FRETet audž Dr Daǀid LAURIN et le Dr Caroline ASPORD ă l'EFS pour l'analyse des

cytokines et les discussions scientifiques 4

Bien logiquement

J'ai Ġgalement une pensĠe pour notre rossignol du labo, Jean- sifflotements, son Jazz et ses discussions photos m'a permis de me changer les idĠes.

J'adresse bien sur un Ġnorme merci

J'ai Ġgalement une pensĠe pour nos informaticiens de choc, Fabrice et Didier, et pour nos

5 Table

Remerciements

Table des matières

Table des illustrations

Table des tableaux

Liste des abréviations

CHAPITRE I

CHAPITRE II

Transfection d'ADN

Transfection d'ARN interfĠrents (ARNi)

6 3.2.

Utilisation d'une protĠine fluorescente

Obtention des surnageants de phagocytose pour l'analyse des cytokines.....................

Obtention des protĠines d'intĠrġt

Mesure d'un signal de FRET

Obtention d'un signal de FRET

CHAPITRE III

Mise en Ġǀidence d'une interaction directe entre la calrĠticuline et la rĠgion globulaire de

C1q à la surface des cellules apoptotiques

place pour la dĠtection d'une interaction par FRET Edžpression d'une calrĠticuline en fusion aǀec la GFP Edžpression d'une calrĠticuline en fusion aǀec SNAP

DĠtection d'une interaction par FRET

7 2.

DĠǀeloppement d'un test de phagocytose

Etat d'apoptose des cellules phagocytĠes

Niǀeau d'edžpression de la calrĠticuline des cellules phagocytĠes........................

Etude de l'interaction C1q

i sur l'edžpression de cytokines par les THP phagocytose Colocalisation d'ERp57 et de la calréticuline avec C1q à la surface des cellules HeLa Production et purification des diffĠrents domaines d'ERp57...............................

EdžpĠriences d'interaction in ǀitro

CHAPITRE

8

Annexes

Article

Références

Résumé

9 Table l'apoptose

Figure 3͗ ReprĠsentation des maladies communes associĠes ă une dĠrĠgulation de l'apoptose

Figure 4

Figu

Figure 6

Figure 7

Figure 8

Figure 9

Figure 10

Figure 11

d'actiǀation du compledže C1

Figure 12

Figure 13

Figure 14

calrĠticuline lors de l'apoptose Figure 15͗ SchĠma des diffĠrentes Ġtapes du clonage pour l'obtention du plasmide psig- Figure 16͗ SchĠma des diffĠrentes Ġtapes du clonage pour l'obtention du plasmide psig- Figure 17͗ SchĠma des diffĠrentes Ġtapes du clonage pour l'obtention des plasmides pGEy-

Figure 18

Figure 19

Figure 20 : Analyse en dot plot CFSE/CD11cPE de la phagocytose de cellules HeLa irradiées aux UV Figure 21 : Analyse en dot plot APCCy7ͬAPC des diffĠrentes cytokines d'intĠrġt

Figure 22 : Principe du marquage CBA

Figure 23

Figure 24 : Exemple de FRET entre deux fluorophores Figure 25 : Exemple de recouvrement entre le spectre d'Ġmission du donneur et le spectre 10 Figure 26 : Illustration des coefficients de Pearson et Manders Figure 27 ͗ Principe de la dĠtection d'une interaction par résonance plasmonique de surface Figure 28 ͗ Sensorgramme reprĠsentant un cycle d'analyse aǀec les phases d'association, de dissociation et de régénération

Figure 29

Figure 30 : Analyse de la production transitoire de la calréticuline en fusion avec la GFP

Figure 31 : Localisation de la calré

Figure 32 ͗ Analyse de l'edžpression en surface de la calrĠticuline endogğne et de la calrĠticuline en

fusion avec la GFP

Figure 33͗ Analyse de l'immunoprĠcipitation de la calrĠticuline en solution aǀec Triton et EDTA

Figure 34͗ Analyse de l'immunoprĠcipitation en solution de lyse aǀec NP-

Figure 35

Figure 36 : Analyse de la production transitoire de calréticuline en fusion avec SNAP

Figure 37 : Localisation de la calréticuline en fusion avec la protéine SNAP exprimée transitoirement

Figure 38 ͗ Analyse de l'edžpression en surface du signal de la calrĠticuline et du signal SNAP

Figure 39 : Schéma représentatif de la stratégie développée pour obtenir un signal de FRET en

Figure 40 : Analyse de la colocalisation en surface des photoblanchiment sur des cellules témoins colocalisation "en Figure 43 : Graphique représentatif de l'analyse des intensitĠs de fluorescence aprğs

systğme confocal ă roue de Nipkow aprğs photoblanchiment et analyse de l'efficacitĠ de FRET

sur des cellules apoptotiques apoptotiques Figure 46 : Analyse de la libération de calréticuline après "

Figure 47 : Détection de la séquence C

Figure 48 ͗ PrĠsentation du modğle de phagocytose utilisĠ pour Ġtudier l'interaction fonctionnelle de

C1q 11

Figure 49 : Caractérisation morphologique par microscopie des THP1 aprğs 72h d'induction au PMA

Figure 50 : Caractérisation par cytométrie en flux des THP Figure 51 : Détection par cytométrie en flux du C1q présent à la surface des THP

Figure 52 : Analyse de la phagocytos

Figure 53 ͗ Eǀolution de l'apoptose des cellules HeLa traitĠes par ARNi CRT aprğs irradiation audž UV

Figure 54 : Quantification du marquage Annexine

Figure 55 ͗ Eǀolution de l'apoptose des cellules MEF CRT -

Figure 56 : Quantification du marquage Annexine

Figure 57 : Effet de C1q sur la phagocytose des cellules He Figure 58 : Effet de C1q sur la phagocytose des cellules HeLa apoptotiques tardives Figure 59 ͗ Analyse de l'edžpression de la calrĠticuline dans les cellules HeLa Figure 60 ͗ Analyse de l'edžpression de la calrĠticuline dans les cellules MEF Figure 61 : Quantification de la phagocytose de cellules HeLa ARNi viables ou apoptotiques par des n fonction de l'inducteur d'apoptose Figure 62 : Analyse de la phagocytose de cellules HeLa ARNi apoptotiques par des THP

Figure 63 : Variation de la phagocytose en absence de calréticuline en fonction de l'Ġtat d'apoptose

des cellules phagocytées Figure 64 : Effet de C1q sur la phagocytose par des THP

Figure 65 : Analyse de la pha

Figure 66 : Effet de C1q sur la phagocytose des MEF apoptotiques déficientes ou non en calréticuline

Figure 67 : Effet de C1q sur la p

Figure 68 : Analyse de la variation de la phagocytose de en présence de C1q cellules MEF par des Figure 69 :Analyse de l'impact de l'absence de calrĠticuline sur la production d'IL- 12 m suite ă la phagocytose de cellules MEF dont l'apoptose a ĠtĠ induite par

UV ou mitoxantrone

m suite ă la phagocytose de cellules MEF dont l'apoptose a ĠtĠ induite par UV ou mitoxantrone HeLa constructions en fusion avec la GST

Figure 78 : Production et purification de GST

Pdomaine de la calréticuline

Figure 81 : Rôle de la calréticuline à la surface des cellules apoptotiques et des macrophages

Figure 82 ͗ Proposition d'un modğle de reconnaissance des ACAMPs ă la surface des cellules apoptotiques par C1q

Figure 83

Figure 84

Figure 85

Figur

Figure 87

Figure 88

Figure 89

Figure 90

Figure 91

Figure 92

Figure 93

Figure 94

13 Table Tableau 1 ͗ Paramğtres de transfection pour l'ADN

Tableau 2 : Paramètres de transfec

Tableau 3 : Séquences des ARNi

Tableau 4 ͗ Conditions d'induction d'apoptose

Tableau 5 ͗ Conditions de milieu pour l'irradiation en fonction du récipient de culture Tableau 6 : Amorces utilisées pour les constructions de calréticuline

Tableau 7 ͗ Protocole PCR pour obtenir l'ADN de la calrĠticuline nĠcessaire ă la construction

Tableau 8 ͗ Protocole PCR pour la mutagenğse dirigĠe permettant l'insertion du peptide signal

nécessaire à la construction du plasmide psig

Tableau 9 ͗ Protocole PCR pour obtenir l'ADN de la calrĠticuline nĠcessaire ă la construction du

plasmide psig

Tableau 10 ͗ Protocole PCR pour obtenir l'ADN du peptide signal de la calrĠticuline nĠcessaire ă la

construc

Tableau 11 ͗ Amorces utilisĠes pour les constructions des domaines d'ERp57................................

Tableau 12 ͗ Protocole PCR pour obtenir l'ADN codant pour les diffĠrents domaines d'ERp57.

Tableau 13 : Configuration du FACScan

Tableau 15ficients d'edžtinction molaire et masses molaires des protĠines purifiĠes

Tableau 16 ͗ Conditions d'immobilisation des ligands sur la Chip CM5 pour les analyses d'interaction

en Biacore Table

Tableau 18͗ DĠtermination des conditions d'apoptose des cellules................................

Tableau 19͗ Cytokines et chĠmokines d'intĠrġt Tableau 20͗ DĠtermination des constantes d'affinitĠ 14 15

Liste des abréviations

A488 Alexa 488

ABC ATP Binding Cassette transporter

Ac Anticorps

ACAMPS Apoptotic Cell Associated Molecular Pattern

ADN Acide DéoxyriboNucléique

ADNc ADN codant

ALPS Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome

APAF1 Apoptotic Protease-Activating Factor-1

APC AlloPhycoCyanin

ARN Acide RiboNucléique

ARNi ARN interférant

ARNm ARN messager

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adénosine TriPhosphate

AVC Accident Vasculaire Cérébral

BAD Bcl-2-Associated Death promoter

BAI1 Brain-specific Angiogenesis Inhibitor 1

BAK Bcl-2 homologous Antagonist Killer

BAX Bcl-2-Associated X protein

BCA Acide bicinchonique

BCL B-cell Lymphoma 2

BG Benzylguanine

BIA Biospecific Interaction Analysis

BID BH3-Interacting Domain death agonist

BSA Bovine Serum Albumin

C. elegans Caenorhabditis elegans

C1qCLF partie collagène de C1q

C1qGR têtes globulaires de C1q

Caspases Cysteine-aspartic protéases

CBA Cytometric Bead Array

cC1qR Receptor of the C1q collagenous domain

CD Cluster de différenciation

ced C. elegans cell death

CFSE CarboxyFluorescein Succinimidyl Ester

CMH Complexe Majeur d'Histocompatibilité

CNX Calnéxine

CP Benzylchloropyrimidine

CR Complement Receptor

CRP Complement Reactive Protein

CrkII CT10 regulator of kinase II

CRT Calréticuline

Cter C-terminal

Cy3 Cyanine 3

D-MEM Dulbecco's modiĮed EagleΖs medium

Da Dalton

DABCO 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane

DAF decay-accelerating factor

DAPI 4',6'-diamidino-2-phénylindole

DC Cellules dendritiques

16

DIC Contraste interférentiel différentiel

DISC Death-Inducing Singaling Complex

DMSO Dimethyl Sulfoxide

DO Densité Optique

DR Death Receptor

DTT Dithiothréitol

E. coli Escherichia Coli

EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

EDTA Ethylene-diaminetetraacetic acid

EFS Etablissement Français du Sang

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

ELMO Engulfment and Cell Motility

ERp57 Endoplasmic Reticulum protein 57 kDa, PDIA 3

ESI Ionisation par Electronébulisation

FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting

FADD Fas Associated protein with Death Domain

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FL Fluorescence

FLIM Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy

FSC Forward Scatter

G418 Généticine/néomycine

GADD34 Growth Arrest and DNA Damage-inducible protein

GAS Growth Arrest-Specific gene

GFP Green Fluorescent Protein

GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor

GPI Glycosyl-Phosphatidylinositol (ancre)

GR Têtes globulaires de C1q

GSH Glutathion

GST Glutathion S-Transferase

GTP Guanosine Triphosphate

GULP Engulfment adaptor Protein

HAT Histone AcetylTransferases

HBS Hepes Buffer Saline

HeLa Henrietta Lacks cells

Hepes Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique

HLA-DR MHC class II cell surface receptor

HRP Horse Radish Peroxidase, péroxydase du raifort

IAB Institut Albert Bonniot

IBS Institut de Biologie Structurale

ICAM Intercellular Adhesion Molecule

IL Interleukine

INF Interféron

IP Immunoprécipitation

IPTG Isopropyl ɴ-D-1-thiogalactopyranoside

K41 Cellules MEF WT pour la calréticuline

K42 Cellules MEF KO pour la calréticuline

ka Constante d'association

KD Constante d'affinité

kd Constante de dissociation kDa kilo Dalton KDEL Séquence (Lys-Asp-Glu-Leu) de rétention dans le réticulum endoplasmique 17

LB Lysogeny broth

LC Chromatographie Liquide

LDL Low Density Lipoprotein

LOX Lectin like oxidized LDL receptor

LPC Lysophosphatidylcholine

LPS Lipopolysaccharide

LRP Lipoprotein Receptor-related Proteins

MV/R Coefficient de Manders

MAC Complexe d'attaque membranaire

MASP MBL associated serine protease

MBL Mannose-binding lectin

MCP Membrane Cofactor Protein

MCS Site multiple de clonage

MEF Mouse embryonic Fibroblast

MFG-E8 Milk fat globule-EGF-factor 8

MFI Moyennes d'intensité de fluorescence

MHC Major histocompatibility complex

moDC Cellules dendritiques obtenues à partir de la différenciation de monocytes MOMP Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization

MS Spectométrie de masse

MTX Mitoxantrone

NBT/BCIP Nitro-Blue Tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt

NCCD Nomenclature Committee on Cell Death

NHS N-Hydroxysuccinimide

NK Natural Killer

NP-40 Nonidet P-40

Nter N-terminal

NZ amine Casein hydrolysate

oxyLDL LDL oxydés p/v poids/volume

PAF Platelet activating factor

PAMPS Pathogen associated molecular pattern

pb paire de bases

PBMC Peropheral blood mononuclear cell

PBS Phosphate Buffered Saline

PBS-T Phosphate Buffered Saline comprenant du Tween

PCC Pearson's Correlation Coefficient

PCD Programmed cell death

PCR Polymerase chain reaction

Pdomaine Domaine structural P de la calréticulinequotesdbs_dbs25.pdfusesText_31

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