[PDF] Intérêts et limites des compléments alimentaires dans la

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THÈSE DE DOCTORAT DE L"UNIVERSITÉ DE LYON

opérée au sein de l"Université Claude Bernard Lyon 1

École Doctorale ED 476

Neurosciences et Cognition

Spécialité de doctorat : Neurosciences

Soutenue publiquement le 06/04/2018, par :

Hugo Calligaro

Réponse à la lumière de l"horloge rétinienne : photorécepteurs et mécanismes moléculaires mis en jeu

Devant le jury composé de :

Hicks David, DR, CNRS UPR3212, Strasbourg Rapporteur Klarsfeld André, Professeur, ESPCI, Paris Rapporteur Delettre Cécile, CR1, INSERM U1051, Montpellier Examinatrice Tilikete Caroline, PU-PH, INSERM U1028, Bron Examinatrice Dkhissi-Benyahya Ouria, CR1, INSERM U1208, Bron Directrice de thèse ii 9LFH

9LFHSUpVLGHQWGHOD&RPPLVVLRQ5HFKHUFKH

'LUHFWULFH*pQpUDOHGHV6HUYLFHV

0OH3URIHVVHXU'LGLHU5(9(/

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'LUHFWHXU0PHOD3URIHVVHXUH$06&+277 COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE )DFXOWpGHV6FLHQFHVHW7HFKQRORJLHV 'pSDUWHPHQW%LRORJLH 'pSDUWHPHQW&KLPLH%LRFKLPLH 'pSDUWHPHQW*(3 'pSDUWHPHQW,QIRUPDWLTXH 'pSDUWHPHQW0DWKpPDWLTXHV 'pSDUWHPHQW0pFDQLTXH 'pSDUWHPHQW3K\VLTXH

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,QVWLWXW8QLYHUVLWDLUHGH7HFKQRORJLHGH/\RQ (FROH6XSpULHXUHGX3URIHVVRUDWHWGH ,QVWLWXWGH6FLHQFH)LQDQFLqUHHWG $VVXUDQFHV 'LUHFWHXU0)'(0$5&+, 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU)7+(9(1$5' 'LUHFWHXU0PH&)(/,; 'LUHFWHXU0+DVVDQ+$00285, 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU6$..28&+( 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU*720$129 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU+%(1+$',' 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU-&3/(1(7 'LUHFWHXU0<9$1328//( 'LUHFWHXU0%*8,'(5'21, 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU(3(55,1 'LUHFWHXU0*3,*1$8/7 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU&9,721 'LUHFWHXU0OH3URIHVVHXU$028*1,277( 'LUHFWHXU01/(%2,61( iv

Cette thèse a été préparée au

Institut Cellule Souche et Cerveau, INSERM U1208

18 avenue Doyen Lépine

69675 Bron cedex - France

?+33 (0)4 72 91 34 75 ?+33 (0)4 72 91 34 61 ?u1208@inserm.fr

Sitehttp://www.sbri.fr

vii

Science is nothing but a series of

questions that lead to more questions.

Pratchett(The Longue Earth)

All models are wrong but some are

useful. Box viii

Résuméix

Réponse à la lumière des horloges rétiniennes : Photorécepteurs et mécanismes molécu-

laires mis en jeu

Résumé

La rétine contient une horloge endogène régulant différentes fonctions rythmiques et participae

à la synchronisation de l"horloge centrale du SCN au temps géophysique. Cette synchronisation

met en jeu les bâtonnets, les cônes et les cellules à mélanopsine. Contrairement au SCN, le

rôle des photorécepteurs dans la réponse à la lumière de l"horloge rétinienne est controversé.

Nos travaux et ceux d"autres équipes soutiennent un rôle de la mélanopsine alors que 2 études

récentes suggèrent que seule la neuropsine est impliquée. Mon projet vise à disséquer le rôle des

différents photorécepteurs par des approchesin vitro/ex vivochez des souris sauvages,Per2 Luc et/ou déficientes en photorécepteurs.

Des lumières monochromatiques ciblant différents photorécepteurs ont été appliquées à des

explants rétiniens en culture de sourisPer2 Luc ou déficientes en mélanopsine, cônes MW ou

bâtonnets. Nos résultats montrent un rôle des bâtonnets dans le décalage de phase de l"horloge

rétinienne par la lumière dans le spectre visible et une contribution additionnelle des cônes SW

et/ou de la neuropsine dans l"UV. L"horloge rétinienne étant composée de plusieurs horloges et

afin de déterminer leur réponse à la lumière, l"induction photique des gènesPer1-Per2etC-Fos

a été analysée dans les couches rétiniennes isolées chez des souris sauvages et déficientes en

photorécepteurs. Chez les souris sans mélanopsine ou cônes MW, l"induction dePer1-Per2est abolie dans toutes les couches, suggérant un rôle de ces photorécepteurs.

En résumé, nos résultats indiquent un rôle différentiel des photorécepteurs en fonction de la

réponse mesurée (décalage de phase de PER2::Luc et induction des gènes de l"horloge par la

lumière). Mots clés :rétine; horloge circadienne; photoréception; lumière; bâtonnet Light response of the retinal clocks: Photoreceptors and molecular mechanisms in- volved

Abstract

The mammalian retina contains an endogenous pacemaker regulating retinal physiology and participate to the sybchronization of the temporal phase of the central clock of the SCN to environmental time. This entrainment processinvolves rods, cones and melanopsin-containing retinal ganglion cells. In contrast with the SCN, the role of these photoreceptors in the light response of the retinal clock is still controversial. While recent studies suggest that none of them is involved in light response of the retinal clock, others support a role for melanopsin. My project aims to dissect the role of these different photoreceptors in wild-type,Per2 Luc and/or photoreceptor-deficient mice usingin vitro/ex vivoapproaches. Monochromatic lights targeting different photoreceptors were applied to retinal explants of Per2 Luc or melanopsin-, MW cones- or rods-deficient mice. Our results demonstrate that rods are required for the light-induced phase shift of the retinal clock in the visible spectrum and suggest an additional contribution of SW cones and/or neuropsin in the UV. As the retinal clock is composed of several clocks and in order to determine their response to light, the photic induction ofPer1-Per2andC-Fosgenes was analyzed in isolated retinal layers from wild-type and photoreceptor-deficient mice. In mice without melanopsin or MW cones,Per1-Per2induction by light is abolished in all layers, suggesting a role for these photoreceptors. In summary, our results propose a differential contribution of the retinal photoreceptors as a function of the response recorded (phase shift of PER2::Luc or induction of clock genes by light). Keywords:retina; circadian clock; photoreception; light ; rod

Institut Cellule Souche et Cerveau, INSERM U1208

18 avenue Doyen Lépine - 69675 Bron cedex - France -

xRésumé

Sommaire

Résuméix

Sommairexi

Avant-Propos xv

Acronymes xvii

Table des figures xix

Liste des tableaux xxi

1 Le système circadien 1

1.1 Rythmes circadiens : unités d"organisation de la vie physiologique.... 1

1.1.1 Historique................................ 1

1.1.2 Définitions et lexique du système circadien............ 2

1.2 Le système circadien des mammifères................... 5

1.2.1 Fonctionnement moléculaire des horloges circadiennes..... 5

1.2.1.1 Découverte des gènes de l"horloge............ 5

1.2.1.2 Les boucles positive CLOCK / BMAL1 et négative PER

/CRY ............................. 7

1.2.1.3 Les boucles secondaires : REV-ERB et ROR....... 9

1.2.1.4 Autres acteurs de régulation............... 9

1.2.2 L"organisation du système circadien................. 10

1.2.2.1 L"horloge centrale..................... 10

1.2.2.2 Un réseau d"horloges.................... 12

2 L"horloge de la rétine 17

2.1 Anatomie de la rétine.............................. 17

2.1.1 Anatomie générale........................... 17

2.1.2 La couche des photorécepteurs................... 18

2.1.2.1 Les bâtonnets........................ 18

2.1.2.2 Les cônes.......................... 18

2.1.3 La couche nucléaire interne..................... 20

xi xiiSommaire

2.1.3.1 Les cellules bipolaires................... 20

2.1.3.2 Les cellules horizontales.................. 20

2.1.3.3 Les cellules amacrines................... 20

2.1.4 La couche des cellules ganglionnaires................ 21

2.1.4.1 Les cellules ganglionnaires intrinsèquement photosen-

sibles............................. 22

2.1.5 Les cellules gliales et épithéliales.................. 23

2.1.5.1 Les cellules de Müller................... 23

2.1.5.2 L"épithélium pigmentaire................. 23

2.2 Horloge rétinienne................................ 24

2.2.1 Découverte de l"horloge rétinienne.................. 24

2.2.2 Des activités rythmiques dans la rétine................ 24

2.2.3 Une horloge ou des horloges rétiniennes?............. 26

2.2.4 Couplage des horloges rétiniennes................. 28

2.2.5 Effet de la délétion de gènes de l"horloge.............. 30

2.2.6 Maladies rétiniennes et lien avec l"horloge rétinienne....... 31

2.3 Réponse à la lumière de la rétine...................... 32

2.3.1 Réception de l"information lumineuse............... 32

2.3.1.1 Opsines et sensibilité spectrale.............. 32

2.3.1.2 Phototransduction au sein des bâtonnets et des cônes . 33

2.3.1.3 Phototransduction des ipRGCs............... 34

2.3.2 Transmission de l"information lumineuse par les cônes et les bâ-

tonnets................................. 36

2.3.3 Transmission de l"information lumineuse par les ipRGCs . . . . 38

2.4 Entraînement et réponse à la lumière deshorloges centrale et rétinienne 39

2.4.1 Horloge centrale............................ 39

2.4.2 Horloge rétinienne........................... 41

2.4.2.1 Lalumièrecommesynchronisateurdel"horlogerétinienne 41

2.4.2.2 Rôles des photorécepteurs.................. 44

3 Objectifs et stratégies expérimentales 47

3.1 Objectifs de la thèse............................... 47

3.2 Stratégies expérimentales........................... 49

3.2.1 Approchein vitro: intérêt de la bioluminescence......... 49

3.2.1.1 La sourisPer2

Luc ...................... 49

3.2.1.2 Intérêt du modèle..................... 49

3.2.1.3 Mesure de bioluminescence dans la rétine........ 50

3.2.2 Approchein vivo: intérêt de la microdissection des différentes

couches de la rétine........................... 51

3.2.3 Stimulations lumineuses monochromatiques........... 52

3.2.4 Modèles murins dépourvus de photorécepteurs.......... 53

3.2.5 Développement de nouveaux modèles murins........... 56

Sommairexiii

4 Matériels et Méthodes 57

4.1 Animaux..................................... 57

4.1.1 Hébergement.............................. 57

4.1.2 Génotypage............................... 57

4.1.3 Activité luciférase........................... 58

4.1.4 Prélèvement de rétine pour la biologie moléculaire........ 59

4.2 Approchein vitro: analyse de l"horloge rétinienne par bioluminescence 59

4.2.1 Culture des explants rétiniens.................... 59

4.2.2 Stimulations mécaniques et lumineuses des explants rétiniens . 60

4.2.3 Analyses................................ 63

4.2.3.1 Oscillations de PER2 : :Luc................ 63

4.2.3.2 Détermination du temps biologique de l"horloge réti-

niennein vitro....................... 63

4.2.3.3 Décalage de phase de l"oscillation de PER2 : :Luc.... 63

4.2.3.4 Modélisation........................ 65

4.3 Approchein vivo: analyse de la réponse à la lumière des horloges réti-

niennes..................................... 66

4.3.1 Activité locomotrice......................... 66

4.3.2 Stimulations lumineusesin vivo................... 66

4.3.3 Microdissection laser.......................... 67

4.4 Biologie moléculaire............................... 67

4.4.1 Extraction des ARN totaux....................... 67

4.4.2 Transcription inverse des ARN totaux............... 68

4.4.3 Réaction de polymérisation en chaine en temps réel....... 68

4.5 Histologie.................................... 69

4.6 Analyses statistiques............................. 70

5 Résultats 71

5.1 Développement d"un protocole standardisé de culture d"explants de ré-

tines........................................ 71

5.1.1 Effet du renouvellement de milieu de culture des explants sur la

phase d"expression de PER2 : :Luc................... 71

5.1.2 Effets des déplacements mécaniques des explants rétiniens sur la

phase de l"horloge rétinienne.................... 72

5.2 Rôle des bâtonnets dans le décalage de phase par la lumière de l"horloge

rétinienne.................................... 76

5.3 Induction par la lumière des gènes de l"horloge dans les oscillateurs ré-

tiniens...................................... 102

5.3.1 Induction dePer1,Per2etC-Fospar la lumière visible chez les

souris WT et photorécepteurs-déficientes............. 102

5.3.2 Induction dePer1-Per2etC-Fospar la lumière UV chez les souris

WT ....................................104

xivSommaire

6 Discussion 107

6.1 Développement d"un protocole standardisé de culture d"explants rétiniens107

6.1.1 EffetdudéplacementdesboîtesdeculturesurlaphasedePER2::Luc

..................................... 109

6.2 Réponse globale de l"horloge rétinienne à lumière..............111

6.2.1 Sensibilité à la lumière de l"horloge rétinienne...........111

6.2.2 Rôle des photorécepteurs dans la réponse à la lumière de l"hor-

loge rétinienne............................. 113

6.2.3 Effet de l"absence d"un photopigment sur la période endogène de

la rétine................................ 116

6.3 Réponse des horloges rétiniennes à la lumière............... 118

7 Conclusions et perspectives 121

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