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Université Pierre et Marie Curie

Ecole doctorale 515 Complexité du vivant

Laboratoire Adaptation biologique et vieillissement, CNRS UPMC UMR8256

Equipe de recherche Traduction eucaryote

Par Affaf ALIOUAT

Thèse de doctorat de Biochimie et Biologie moléculaire

Dirigée par

Dr. Olivier JEAN-JEAN et Dr. Samia SALHI

Présentée et soutenue publiquement le 12 juillet 2017

Devant un jury composé de :

Dr. Jean-jaques DIAZ Rapporteur

Dr. Stefania MILLEVOI Rapporteur

Pr. Ali LADRAM Examinateur

Dr. Christine ALLMANG Examinateur

Dr. Olivier JEAN-JEAN Directeur de thèse

Dr. Samia SALHI Co-directrice de thèse

Sommaire

1

Introduction 4

4 4 4

1.2. Epissage des ARN messagers 5

7 8

II. La traduction chez les eucaryotes 10

11 13

1.1.1. Formation du complexe de pré-initiation 43S 13

1.1.1.1. La formation du complexe ternaire eIF2-GTP-Met-ARNtiMet 15

1.1.1.2. -initiation 43S 15

1.1.2. Formation du complexe eIF4F 16

17

1.1.4. Balayage ou "scanning" 17

1.1.5. Reconnaissance du codon initiateur 18

1.1.6. Les déterminants de la reconnaissance du codon initiateur 18

1.1.7. Arrivée de la sous-unité ribosomique 60S 19

1.2. Le cas du premier tour de traduction 20

21

3. La terminaison de la traduction et le recyclage des ribosomes chez les eucaryotes 22

3.1. Les principaux facteurs de terminaison et de recyclage 23

3.1.1. Le facteur eRF1 23

3.1.2. Le facteur eRF3 25

3.1.3. Le facteur Upf1 27

3.1.4. La protéine ABCE1 28

3.2. Le mécanisme de terminaison de la traduction 29

3.2.1. Reconnaissance des codons stop 30

3.2.2. Translecture des codons stop 31

3.2.3. Libération de la protéine néo-synthétisée 32

3.2.4. Dissociation du complexe de terminaison et recyclage des ribosomes 34

4. La réinitiation de la traduction chez les eucaryotes 36

III. Dégradation et surveillance des ARNm eucaryotes 37

1. Mécanisme général de dégradation cytoplasmique des ARNm 37

1.1. La désadénylation 39

1.2. -- 40

1.3. Coupures endonucléolytiques 40

1.4. Sites cytoplasmique de la dégradation des ARNm 40

2. La surveillance des ARNm et la dégradation des ARNm aberrants 41

2.1. Les acteurs majeurs de la voie NMD 42

2.1.1. Les protéines Upf 42

2.1.2. Les protéines SMG 44

2.2. Le complexe de Jonction Exon-Exon (EJC) 44

2.3. Mécanisme de dégradation des transcrits contenant des codons non-sens (NMD) 45

48
traduction 48

1.1. Régulation par le facteur eIF2 48

1.2. Régulation par le facteur eIF4E 50

1.2.1. Régulation d'eIF4E par le facteur 4E-BP et la voie TOR 51

53

2. Régulation par les él 55

2. 1. Les mécanismes de régulation de la traduction par les uORF 57

2.2. Les uORF et la réponse au stress 59

2.3. Les uORF et la stabilité des ARNm 62

2.4. Les uORF et les pathologies humaines 63

3. Les Nouvelle technologie pour étudier les mécanismes de régulation traductionnelle 65

3.1. Qu'est-ce que le ribosome profiling ? 67

3.2. Limites du ribosome profiling 72

3.3. Les biais du ribosome profiling 72

3.3.1 Le choix de la nucléase 73

3.3.2. Les empreintes contaminantes 74

3.3.3. Profondeur de séquençage 75

Objectif de la thèse 76

Résultats 78

I. Analyse globale de la traduction des cellules déplétées en eRF3 ou Upf1 78

1. Stratégie d'étude 78

2. Mise au point des expériences de ribosome profiling et de RNA-seq 79

3. Analyse bioinformatique du RNA-seq et du Ribo-seq 82

4. Analyse d'une première série d'expériences de Ribosome profiling 84

5. Analyse d'une deuxième série d'expériences de Ribosome profiling 88

6. Validation des résultats du Ribosome profiling 89

7. Détection des transcrits exprimés dans les cellules HCT116 91

8. Identification des uORF fonctionnelles dans les cellules HCT116 93

97
Article 1 : Involvement of translation termination factor eRF3 and nonsense-mediated mRNA decay factor Upf1 in the translational control of uORFs carrying mRNAs: a genome wide analysis.

II. Effet de la déplétion en Upf1 sur la formation du ribosome 80S 100

Discussion 105

1. Identification des uORF dans le traductome des cellules HCT116 106

2. Usage des codons d'initiation non canoniques par les uORF fonctionnelles 108

3. Rôles respectifs d'eRF3 et Upf1 dans le contrôle traductionnel par les uORF 109

4. Déplétion en eRF3 et translecture des codons stop 110

Bibliographie 113

Annexes 132

Article 2 : Co-translational deadenylation of mRNAs in human cells: the example of MYC mRNA.

Préambule

Préambule

1

La régulation de

acide désoxyribonucléique (ADN),

organisée sous forme de gènes portés par les chromosomes dans le noyau des cellules eucaryotes.

Ces gènes s'expriment selon un programme défini qui régule l'état de prolifération de la cellule. Ce

-temporelle de ces gènes qui doivent ainsi être

exprimés avec le bon taux pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Une variation même

minime des gènes à une prolifération cellulaire non contrôlée à des cancers. L'expression d'un gène se fait par transcription de sa séquence ADN sous forme d'un ARN

dit pré-messager (pré-ARNm) dans le noyau, cette étape est le siège d'une première régulation dite

régulation transcriptionnelle. soumis à une maturation puis exporté vers le cytoplasme sous forme d'ARN messager (ARNm). Au cours de ces processus, un second niveau de régulation m. Une fois dans le cytoplasme, les ARN messagers sont pris en charge par les ribosomes et les facteurs de traduction s. Un troisième niveau de régulation dit post- transcriptionnel et/ou traductionnel intervient à cette étape, protéine. dépend donc de nombreux facteurs qui interagissent pour

favoriser ou réprimer leur action en fonction des besoins cellulaires. Des niveaux supplémentaires

de régulations post- , ce sont par

exemple, la dégradation des ARNm, les modifications post-traductionnelles et la dégradation des

protéines. Toutes ces régulations fonctionnent sous forme de réseaux qui interagissent entre eux.

Ainsi, lrégulation coordonnée de chacun de

ces réseaux.

De façon schématique, lcelui

de , génétique, celui de l'ARNm messager de cette information et

celui des protéines qui assurent les fonctions cellulaires. Ces protéines peuvent avoir des fonctions

diverses : protéines structurales permettant le maintien de l'architecture de la cellule, enzymes

Préambule

2

nécessaires au métabolisme cellulaire, protéines régulatrices de l'expression des gènes. Ces

protéines régulatrices sont des acteurs clés de la prolifération et de la différenciation cellulaire

permettant le développement de l'organisme, l'élaboration des organes et le renouvellement des tissus.

La synthèse des protéines régulatrices est finement contrôlée au cours de la traduction par

des éléments régulateurs portés par leur propre ARN messager. Ce contrôle permet d'adapter

rapidement le taux de ces protéines aux besoins de la cellule. Ce mécanisme de contrôle a une

importance fondamentale parce qu'il concerne tous les types de cellules et affecte donc tous les

tissus. Le défaut ou la perte du contrôle de traduction des ARN messagers codant les protéines

une modification du destin de la cellule et la faire passer sur les mécanismes contrôlant l'expression des gènes au niveau du noyau ont permis de mieux

comprendre les processus mis en jeu au cours de la prolifération cellulaire, les mécanismes

contrôlant la traduction des protéines régulatrices au niveau du cytoplasme sont encore peu décrit.

Mon travail de thèse a été d'étudier l'enchaînement des évènements qui gouvernent la traduction ou

la destruction des ARN messagers, avec une attention particulière pour les ARNm des protéines Chez les Eucaryotes, la traduction des ARNm peut être régulée non seulement au niveau de la machinerie traductionnelle, ribosome et facteurs de traduction, mais aussi par la présence de

motifs de séquence et de structures secondaires au sein même de l'ARNm. Les mécanismes de cette

régulation traductionnelle portée par l'ARNm qui contrôlent spécifiquement la traduction et/ou la stabil

Un de ces éléments régulateurs de la traduction portés par l'ARNm est constitué par un ou

plusieurs petits cadres de lecture, ou uORF pour upstream Open Reading Frame, situés dans la

région 5' non-traduite, en amont du cadre de lecture principal. Plusieurs analyses bioinformatiques

ont révélé que plus de 40% des ARNm de mammifères portent de telles uORF régulatrices (Iacono

et al., 2005; Timothy G. Johnstone et al., 2016; Raj et al., 2016). Ces uORF sont particulièrement

fréquentes dans les transcrits codant des onco-protéines, des récepteurs d'hormones et des

modulateurs transcriptionnels. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels ces éléments

Préambule

3

Ces uORF semblent agir non

seulement en contrôlant la traduction de l'ORF principale mais aussi en modulant la dégradation

des ARNm par la voie de dégradation des ARNm aberrants ou NMD (Nonsense Mediated mRNA

Decay).

Au cours de mon introduction, je reviendrai de façon sommaire sur la transcription de l'ARNm eucaryote, sa maturation et son transport du noyau vers le cytoplasme. Je décrirai plus en

détail l'ARNm cytoplasmique, les différentes étapes de sa traduction, et la régulation de la

traduction en insistant sur le rôle des uORF et leurs moyens d'études.

Introduction

Introduction

4 I. L Dans le noyau de la cellule, la transcription de la séquence ADN sous forme d'un ARN pré- messager débute par le recrutement ordonné de facteurs de transcription formant un complexe de

pré-initiation. Chacun de ces facteurs est lui-même multiprotéiques et joue un rôle précis dans le

la reconnaissance des éléments du promoteur, -de

II) et son activation. L'ARN polymérase II

protéines se fixent à la molécule d et initient les processus de maturation post- - épissage des introns, Ces deux processus, transcription et maturation des ARN se font de façon

simultanée dans les cellules. La terminaison de la transcription est déterminée par plusieurs signaux

dont celui de polyadénylation. 1.1.

Une fois les 25 à 30 premiers nucléotides transcrits, la première étape de la maturation des ARNm

consiste en une coiffe (Shatkin, 1976). La coiffe est en position N7, qui est ajoutée au premier nucléotide -ARNm par une liaison -e. Cette coiffe joue un rôle important dans le métabolisme des ARNm, elle participe en particulier à leur protection contre la dégradation - par les exo- ribonucléases (Lewis and Izaurralde, 1997). De plus, elle joue aussi un rôle important dans la poursuite des étapes ultérieures de maturation et notamment dans les , de

polyadénylation nucléaire, de transport nucléocytoplasmique. Enfin, elle est un élément clé de

la traduction. Dans le noyau, la coiffe est liée à un complexe nucléaire CBC (Cap Binding Complex) constitué des protéines CBP80 et CBP20 (Cap Binding Protein 80 et 20). Ce complexe en plus de

Introduction

5 à la maturation. Grâce à le complexe de coiffe intervient dans dans e dans le processus de matur-ARNm. Après l'export de l'ARNm mature dans le cytoplasme, le complexe CBC nucléaire, par interaction de CBP80 et du eIF4G, permet l'initiation du premier tour de traduction durant lequel

des ARNm par la voie NMD (Kim et al., 2009; Maquat et al., 2010). Cette voie sera détaillée plus

loin dans le chapitre concernant la traduction.

CBC nucléaire est

remplacé par le facteur de coiffe cytoplasmique eIF4E qui fait partie du la traduction eIF4F. Les différents rôles de ces facteurs, dans la circularisation de , dans le recrutement de la machinerie traductionnelle ainsi que dans les processus de régulation de la traduction seront détaillés plus loin dans le chapitre consacré à la traduction.

1.2. Epissage des ARN messagers

Les pré-ARNm sont constitués d'une alternance de séquences qui feront parties de l'ARNm mature,

les exons, et de séquences excisées, les introns. Les introns sont en général dans les régions

codantes, plus rarement dans de l'ARNm et exceptionnellement dans la région 33. Au cours de leur maturation les pré-ARNm subissent une imination des introns, pour ne conserver que les exons

et les lier entre eux (Jurica and Moore, 2003). La taille des introns varie de quelques dizaines à

plusieurs centaines de milliers de nucléotides avec une taille moyenne de 1900 nucléotides (nt) contre 125 nt pour les exons. Oen moyenne 7,8 introns contre

8,8 exons par gène (Hoskins and Moore, 2012).

s en deux réactions de trans- estérifications successives (Jurica and Moore, 2003).

Le spliceosome reconnait -

estérifications par rapprochement des sites donneurs et accepteurs d'épissage situés de part et

(Will and Luhrmann, 2011)(Exon

Introduction

6

Junction Complex) est alors déposé par le spliceosome, 24 nucléotides en amont de la jonction

exon-exon (Le Hir, 2000; Le Hir et al., 2000). , qui le cytoplasme, participe aussi à la localisation subcellulaire des ARNm ainsi que dans la régulation de leur niveau de traduction

(Giorgi and Moore, 2007). Enfin, l'EJC joue un rôle clé dans le contrôle de qualité des ARNm et

. Dans ce cas, certains exons peuvent être

exclus et, de la même façon, certains introns peuvent être maintenus dans la séquence de l'ARNm

mature (Figure 1). Ainsi, à la fin de l'

60% des gènes subissent un processus d'épissage alternatif, permettant de générer 100 000

protéines différentes à partir des 24 000 gènes du génome humain (Nilsen and Graveley, 2010).

Cependant, , cette proportion

semble être beaucoup plus importante et il semblerait qu'environ 90% des gènes sont le siège d'un

(Wang et al., 2008). L'épissage alternatif est un processus important de la régulation de l'expression des gènes.

Figure 1 :

alternatif des ARN pré-messagers. En bleu les exons constitutifs, en violet les exons alternatifs, et en traits pleins les introns. Différentes combinaisons rétention s sont représentéesutilisation de multiples promoteurs peut aussi modifier Enfin, l signaux de polyadénylation distincts (Corcos and Solier, 2005).

Introduction

7 1.3.

A la fin de la transcription, la maturation des pré-ARNm se termine par l'ajout d'une séquence poly-

Adénosine ou poly(A) en 3'de la région . ous les transcrits eue poly(A) peut avoir une taille variable selon le transcrit, allant de 200 à 300 résidus adénosine L'ajout de la queue poly(A) se fait en plusieurs étapes. Dans un premier temps, les pré-ARNm sont clivés au niveau DSE pour

DownStream Element, dans une région située à environ 10 à 30 nucléotides en aval du signal de

polyadénylation, typiquement de forme AAUAAA. Une dizaine de résidus adénosine sont alors ajoutés Poly(A) Polymerase (PAP). La distance entre le signal AAUAAA et le DSE iche en résidus U appelée USE pour UpStream Element les modalités du clivage ne sont que partiellement connues. Deux facteurs, le CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) et le CstF (cleavage stimulation factor), qui se fixent respectivement sur le signal AAUAAA et sur le DSE, sont indispensables (Millevoi and Vagner,

2010). De même, la PAP semble intervenir dans le processus, mais la

endonucléase - OH sur les pré- ARNm, à laquelle la PAP ajoute une dizaine de résidus A, alors que le fragment présentant -phosphate est rapidement dégradé. Dans un second temps, la séquence poly(A) est

allongée, et cette extension dépend uniquement de la présence des 10 premiers résidus

précédemment ajoutés et du CPSF. En effet, la séquence de 10 résidus A est nécessaire et suffisante

pour que la protéine PABPN1 (Poly(A) Binding Protein Nuclear 1) , en coopération avec le CPSF, de la PAP en augmentant sa processivité (Kühn and Wahle,quotesdbs_dbs46.pdfusesText_46

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