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1

N° d'ordre 281-2011

Année 2011

THESE DE L'UNIVERSITE DE LYON

Délivrée par

L'UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

ECOLE DOCTORALE

EDISS

Pour l'obtention

du DIPLOME DE DOCTORAT (arrêté du 7 août 2006)

Soutenue publiquement le 13 décembre 2011

par

Ahmed HODROGE

TITRE Les mutations spontanées du gène Vkorc1 chez l'homme et le rat.

Réalité de la résistance.

Directeur de thèse : Pr Etienne BENOIT & Dr Virginie LATTARD

JURY :

Mme Virginie LATTARD Chargée de Recherche CR1 CNRS- Nancy 1 Mme Sophie RAHUEL-CLERMONT Chargée de Recherche CR 1, CNRS-Nancy 1 Mme Helene GREIGE-GERGES Professeur, Faculté des Sciences-2- Liban M Etienne BENOIT Professeur, Campus Vétérinaire UCBL1 M François MION Professeur, faculté de Médecine UCBL1 M Yves MICHELIN Professeur, Campus agronomique-Clermont M François PENIN Ingénieur de Recherche CNRS UCBL1 Je tiens tout d'abord à remercier les membres de ce jury à Madame le Professeur Helene GREIGE-GERGES, qui m'a fait le plaisir et l'honneur d'être rapporteur de cette thèse et à qui j'exprime ma profonde gratitude. à Madame Sophie RAHUEL-CLERMONT, qui m'a fait l'honneur de s'intéresser à mon travail et qui a accepté d'être rapporteur de cette thèse. à Monsieur le professeur Yves MICHELIN, Directeur adjoint de l'UMR Métafort, qui m'a fait l'honneur et le plaisir d'accepter d'être rapporteur de ce travail. à Monsieur le professeur François MION, pour sa précieuse participation au jury et son soutien. Je le remercie très respectueusement. à Monsieur François PENIN, qui a accepté de participer au jugement de mon travail. à Monsieur le professeur Etienne BENOIT, et Madame Virginie LATTARD, pour leur encadrement, leur enseignement, leur confiance, leurs grandes qualités scientifiques et leur humour. Ce sont eux qui m'ont donné le goût de la recherche. Je leur dis Merci.

Ce travail a été réalisé au sein de " USC 1233 Mycotoxines et toxicologie Comparée des xénobiotiques,

à VetAgro Sup, campus vétérinaire de Lyon » Ce travail a bénéficié du soutien financier du Ministère de l'agriculture et de la pêche, de l'Institut Nationale de la Recherche Agronomique et de VetAgro Sup

A mes parents

Je tiens ensuite à remercier : Etienne BENOIT, qui m'a accueilli et encadré au sein de son laboratoire me

permettant de réaliser ce travail, merci d'être toujours présent Virginie LATTARD, pour sont encadrement, sa confiance, qui m'a appris beaucoup, sans elle c'était loin d'être fini. Un petit coucou à Antoine et Chloé et à la famille BENOIT. Merci évidemment à toutes les personnes de l'école vétérinaire qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de cette thèse, que ce soit d'un point de vue technique ou par un simple soutien. A mes amis (par ordre alphabétique) : Abdé (bro), Adrien, Aurélia, Aymeric, Benjamin (Abdel bechir), Camille, Chloé, Gary, Jérôme (Maître), Olivier. Les amis du service de Biochimie, du service d'informatique et le laboratoire de Tox, d'Alim, du R.U, aux doctorants, pour nos discussions sérieuses et surtout moins sérieuses. A mes compatriotes libanais avec qui j'ai partagé quatre ans sur Lyon et particulièrement à Zeinab, Hussein, Mohamad....

A mon cousin et sa famille.

Je souhaite enfin remercier tous mes proches (Hassan, Ali, Mona, Zahra, Abass, Aziza), en particulier toutes les personnes que j'aime et qui m'aiment. 3

Table des matières

1 INTRODUCTION GENERALE.......................................................................................... 12

2 PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE .......................................................................................... 14

2.1 La coagulation .................................................................................................................... 14

2.1.1 Hémostase primaire ....................................................................................................................... 14

2.1.2 La coagulation plasmatique ........................................................................................................... 16

2.1.3 La Fibrinolyse ou hémostase tertiaire............................................................................................ 19

2.2 Cycle de la vitamine K et coagulation .............................................................................. 21

2.2.1 Les vitamines K ............................................................................................................................. 21

2.2.2 Cycle de la vitamine K .................................................................................................................. 31

2.3 Les anticoagulants antivitaminique K .............................................................................. 46

2.3.1 Historique des antivitamines K ..................................................................................................... 46

2.3.2 Structure et propriétés physico-chimiques des AVKs ................................................................... 47

2.3.3 Mécanismes d'action des AVKs ................................................................................................... 50

2.3.4 Métabolisme des AVKs ................................................................................................................ 51

2.3.5 Utilisation pratique des AVKs en médecine humaine ................................................................... 54

2.4 La résistance aux anticoagulants ...................................................................................... 61

2.4.1 Définition de la résistance ............................................................................................................. 61

2.4.2 Historique de la résistance aux AVKs chez les rongeurs .............................................................. 61

2.4.3 Mécanisme de la résistance aux AVKs ......................................................................................... 64

2.4.4 Réalité de la résistance chez l'homme ........................................................................................... 71

3 OBJECTIFS DE MON TRAVAIL ...................................................................................... 79

4 STRATEGIE ..................................................................................................................... 82

5 MATERIELS ET METHODES .......................................................................................... 83

5.1 Matériels ............................................................................................................................. 83

5.1.1 Réactifs de biologie cellulaire ....................................................................................................... 83

5.1.2 Réactifs biochimiques ................................................................................................................... 83

5.1.3 Réactifs de biologie moléculaire ................................................................................................... 83

5.2 Méthodes expérimentales .................................................................................................. 84

5.2.1 Etude pharmacogénétique ............................................................................................................. 84

5.2.2 Etude biochimique......................................................................................................................... 87

6 RESULTATS .................................................................................................................... 94

6.1 Validation du modèle d'expression hétérologue de l'enzyme VKORC1 ...................... 94

4

6.1.1 Objectifs ........................................................................................................................................ 94

6.1.2 Méthodes ....................................................................................................................................... 95

6.1.3 Principaux résultats ....................................................................................................................... 95

6.2 Etude de l'implication des mutations de rVKORC1 dans la résistance aux AVKs ..... 97

6.2.1 Objectifs ........................................................................................................................................ 97

6.2.2 Méthodes ....................................................................................................................................... 97

6.2.3 Principaux résultats ....................................................................................................................... 97

6.3 Mutations de rVKORC1 et coût biologique .................................................................... 99

6.3.1 Objectifs ........................................................................................................................................ 99

6.3.2 Méthodes ....................................................................................................................................... 99

6.3.3 Principaux résultats ....................................................................................................................... 99

6.4 Détection de nouvelles mutations de Vkorc1 chez des patients résistants aux AVKs 101

6.4.1 Objectifs ...................................................................................................................................... 101

6.4.2 Méthodes ..................................................................................................................................... 101

6.4.3 Résultats ...................................................................................................................................... 102

6.5 Caractérisation biochimique des mutations spontanées de hVKORC1 détectées chez

des patients résistants aux AVKs ................................................................................................. 106

6.5.1 Objectifs ...................................................................................................................................... 106

6.5.2 Méthodes ..................................................................................................................................... 106

6.5.3 Principaux résultats ..................................................................................................................... 106

7 DISCUSSION ................................................................................................................. 108

8 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................ 119

9 BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................... 122

5

Liste des articles

Article publié

Publication 1

Biochemical characterization of spontaneous mutants of rat VKORC1 involved in the resistance to antivitamin K anticoagulants. Auteurs: HODROGE Ahmed, LONGIN-SAUVAGEON Christiane, FOUREL Isabelle, BENOIT

Etienne and LATTARD Virginie.

Revue: Arch Biochem Biophys.

Année: 2011

Articles soumis

Publication 2

The catalytic properties of the major mutations of rVKORC1 explain the biological cost associated to mutation - New insights into the catalytic mechanism Auteurs : LATTARD Virginie, HODROGE Ahmed, MATAGRIN Benjamin, BESSE Stéphane,

FOUREL Isabelle and BENOIT Etienne.

Publication 3

All the spontaneous mutations in hVKORC1 detected in patients resistant to vitamin K antagonists are not associated to a resistant VKOR activity Ahmed Hodroge, Benjamin Matagrin, Caroline Moreau, Isabelle Foure1, Abdessalem

Hammed, Etienne Benoit, and Virginie Lattard

Article (en préparation)

Publication 4

Identification and functional characterization of VKORC1 mutations associated with vitamin K antagonists resistance. Auteurs: Moreau C, Hodroge A, Diry M, Siguret V, Benoît E, Loriot MA and Lattard V 6

Les acides aminés

Alanine Ala A

Arginine Arg R

Asparagine Asn N

Aspartate Asp D

Cystéine Cys C

Glutamate Glu E

Glutamine Gln Q

Glycine Gly G

Histidine His H

Isoleucine Ile I

Leucine Leu L

Lysine Lys K

Méthionine Met M

Phénylalanine Phe F

Proline Pro P

Sérine Ser S

Thréonine Thr T

Tryptophane Trp W

Tyrosine Tyr Y

Valine Val V

7

Liste des abréviations

aa Acide Aminé

ADN Acide désoxyribonucléique

ADNc ADN complémentaire

Afssaps Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé

AINS Anti-inflammatoires non stéroidiens

APOE Apolipoprotéine E gene

ARN Acide Ribonucléique

AVK Antivitamine K

BCR Blood-clotting response

Bp Base Paire

CALU Calumenin gene

Cm Centimorgan

CYP Cytochrome P450

Da Dalton

DO Densité Optique

DTT Dithiotréitol

E. coli Escherichia coli

EDTA Acide Ethylène Diamine Tétra-acétique

EGF Epidermal growth factor

EPHX1 Epoxyde hydrolase 1

FAD Flavin adenine dinucleotide

Gas6 Growth arrest-specific gene 6

GGCX Gamma glutamyl carboxylase gene

Gla Acide glutamique

Glu Acide glutamique carboxylé

GP Glycérophosphate

HTA Hypertension artérielle

INR International Normalized Ratio

ISI Index de Sensibilité Internationale

KH2 Vitamine K hydroquinone

Ki Constante d'inhibition

Km Constante de Michaelis-Menten

KO/KOX Vitamine K époxyde

LC/MS Liquid chromatoraphy mass spectrometry

M Molaire

Mb Mégabase

MGP Matrix gla protein, protéine Gla matricielle

MK Ménaquinone

8 NAPDH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

NQOI NADPH quinone oxydoréductase 1

Oc Ostéocalcineun un Oc= ostéocalcine non gamma carboxylée

OST-PTP Phosphothyrosine phosphatase

PAI Plasminogen Activator Inhibitor

PCR Polymerase chain reaction

PDI Proteine Disulfide Isomérase

PIVKA Protein induced by vitamine K antagonist

PROC Protein C gene

PVKD Protéines vitamines K dépendantes

Q-PCR Quantitative-polymerase chain reaction

RT Reverse transcriptase

rVKORC1 VKORC1 de rat rVKORC1L1 VKORC1L1 de rat

SDS Sodium Dodécyl Sulfate

SHBG Sex hormone-binding globulin

SNP Single Nucleotid Polymorphism

Taq polymérase ADN polymérase de Thermus aquaticus

TBE Tris Borate EDTA

TFPI Inhibiteur du facteur tissulaire

TP Taux de Protrombine

t-Pa Activateur tissulaire du plasminogène

TQ Temps de Quick

Tris Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane

u-Pa Urokinase

UV Ultraviolet

VKOR Vitamine K époxyde réductase

VKORC1 Vitamin K oxyde reductase complex 1

VKORC1L1 Vitamine K époxyde réductase like 1

Vmax Vitesse maximale

VWF Von Willebrand factor

9

Liste des illustrations

1- Liste des figures

Figure 1 : Les différentes étapes de la coagulation Figure 2 : Les différentes étapes de l'hémostase primaire

Figure 3 : Cascades de la coagulation

Figure 4 : Fibrinolyse

Figure 5 : Structure chimique des différentes formes de vitamine K Figure 6 : Rôle potentiel du transporteur ABCC6 dans le transport de la vitamine K Figure 7 : Récepteurs TAM de la protéine Gas6 et de la protéine S

Figure 8 : Le cycle de la vitamine K

Figure 9 : Topologie de VKORC1 proposée par (A) Li et al., (2010) et par (B) Watzka et al., (2010) Figure 10 : Mécanisme réactionnel de la réduction de Vit K>O en Vit K Figure 11 : Mécanisme d'inhibition de VKORC1 par les AVKs (d'après Silverman, 1980) Figure 12 : Schéma de l'interaction entre la caluménine, la VKORC1 et la GGCX Figure 13 : Alignement des séquences protéiques des hVKORC1 et hVKORC1-L1 Figure 14 : Topologie de la VKORC1-L1 (d'après Westhofen et al., 2011) Figure 15 : Schéma du grand cycle de la vitamine K proposé par Weshofen et al., (2011)

Figure 16 : Structure tri-dimensionnelle de NQO1

Figure 17 : Topologie de la gamma-glutamyl-carboxylase (d'après Ti et al., 2000) Figure 18 : Modèle de l'hétérodimère carboxylase - VKORC1 Figure 19 : Réaction chimique catalysée par la gamma-glutamyl-carboxylase

Figure 20 : Séquence de 18 acides aminés situé du côté N-terminal de la protéine décrite par

(Diuguid et al., 1986) Figure 21 : Alignement des séquences (propeptide et protéine mature) de diverses PVKDs Figure 22 : Structure chimique des différentes familles d'AVKs Figure 23 a : Structures chimique des AVKs utilisés en médecine humaine Figure 23 b : Structure chimique de quelques AVKs utilisés comme rodonticide Figure 24 : Inhibition non-compétitive de l'activité VKOR par microsomes de foie de rats sensibles. Représentation Lineweaver and Burk Figure 25 : Métabolisme du coumafène chez l'homme Figure 26 : Métabolisme du coumafène chez le rat 10 Figure 27 : Distribution géographique des résistances chez le rat noire Rattus norvegicus : A) en Europe (Pelz et al., 2005) et B) en France (Grandemange et al., 2010) Figure 28 : Activités VKOR et inhibition par le coumafène des VKORC1 mutantes de rats (A) et de souris (B) après production en cellules HEK293 (Rost et al., 2009) Figure 29 : Résultats des mesures de temps de prothrombine chez les rats Y139/Y139 ; Y139/F139 ; F139/F139, en fonction de la dose d'anticoagulants, pour les 4 AVKs testés : chlorophacinone, bromadiolone, difénacoum et difethialone.

Figure 30: Schéma général des interactions entre le coumafène et 29 gènes potentiellement

impliqués dans son action pharmacologique ou son métabolisme (Wadelius et al., 2007) Figure 31: Rôle des cytochromes 2C9 et 4F2 dans l'homéostasie de la vitamine K Figure 32 : Principe de la discrimination allélique par sonde TaqMan® Figure 33 : Diagramme de discrimination allélique de CYP2C9*2 Figure 34 : Principe de la transformation des levures Pichia pastoris Figure 35 : Expression des protéines recombinantes VKORC1 ou VKORC1-L1 par la levure

Pichia pastoris

Figure 36 : Représentation log- log-linéaire des Ki obtenus à partir des protéines natives en

fonction de ceux des protéines recombinantes Figure 37 : Dose maximale rapportée au seuil de dose élevée de chaque AVK pour chaque patient de notre cohorte présentant une mutation de la zone codante ou du promoteur de

Vkorc1

Figure 38 : Mécanisme proposé pour la formation de 3-OH-vitamine K par les mutants en position 139 Figure 39 : Cycle de la vitamine K et déplétion en vitamine K par formation d'hydroxyvitamines K 11

2- Liste des tableaux

Tableau 1 : Les facteurs de coagulation

Tableau 2 : Protéines vitamine K-dépendantes

Tableau 3 : Propriétés physico-chimiques des principaux anticoagulants utilisés en médecine

humaine ou comme rodonticides Tableau 4 : Indication, recommandation de l'INR cible, durée du traitement par AVKs. (D'après http://afssaps.sante.fr) Tableau 5 : Médicaments reconnus comme interagissant avec les AVKs Tableau 6 : Mutations et polymorphismes trouvés chez la souris Mus musculus provenant de différentes zones géographiques Tableau 7 : Mutations et polymorphismes trouvés chez le rat Rattus norvegicus provenant de différentes zones géographiques

Tableau 8 : Mutations faux-sens du gène Vkorc1 détectées chez des patients résistants aux

AVKs Tableau 9 : Activités VKOR et inhibition par le coumafène des VKORC1 mutantes de l'homme exprimées dans les cellules HEK.

Tableau 10 : Comparaison des

Km des protéines recombinantes à ceux des protéines natives Tableau 11 : Comparaison des Ki des protéines recombinantes à ceux des protéines natives Tableau 12 : Ki des rVKORC1 sauvage et mutées vis-à-vis des différents anticoagulants considérés Tableau 13 : Propriétés catalytiques de rVKORC1 et de ses mutants

Tableau 14 : Récapitulatif des données cliniques, thérapeutiques et génétiques des patients

adressé à l'HEGP pour recherche de facteurs génétiques de résistance aux AVKs et présentant des mutations de VKORC1.

3- Annexe

Annexe 1 : Tableau des amorces des mutations spontanées de vkorc1 12

1 INTRODUCTION GENERALE

Les anticoagulants antivitamine K (AVKs) sont des molécules destinées à empêcher ou à retarder la coagulation du sang. Ils augmentent la fluidité sanguine et sont donc susceptibles de provoquer des saignements. Ce sont des molécules utilisées aussi bien chez l'homme que chez l'animal, même si les molécules utilisées sont différentes. Chez l'homme, les AVKs sont utilisés dans le cadre du traitement et de la prévention de la survenue de phénomènes thromboemboliques (maladie thromboembolique veineuse, prothèses valvulaires cardiaques, fibrillation auriculaire, infarctus du myocarde...). Selon l'AFSSAPS, et en particulier selon l'étude EMIR (Effets indésirables des Médicaments Incidence et Risque), 900 000 patients étaient traités par ces médicaments en France durant

l'année 2007 soit près du double du nombre de patients traités 10 ans plus tôt. Les accidents

hémorragiques et thrombotiques liés à l'utilisation de ces médicaments arrivent au premier

rang des accidents iatrogènes médicamenteux. Environ 17 000 hospitalisations par an sont

dues à ces effets indésirables et les cas mortels sont de l'ordre de 0,6 % des patients traités

(4800 décès par an). Le surdosage est très fréquent et est estimé entre 15 et 30 % des

patients présentant ainsi un facteur de risque (INR>4) hémorragique grave. La difficulté de la

mise en place du traitement est expliquée en grande partie par une variabilité génétique interindividuelle en raison de mutations du gène Vkorc1 codant la cible des AVKs, et du gène CYP2C9 codant l'enzyme impliquée dans le métabolisme des AVKs. Chez les rongeurs, ces molécules sont utilisées comme rodonticides afin de contrôler la prolifération des populations de rongeurs qualifiés de nuisibles. En effet, ces derniers sont capables tant de dévaster des cultures que de détruire des stocks entiers de denrées

alimentaires par consommation directe ou dégradation due à la présence d'excrétats. Ainsi,

les pertes estimées en riz sous l'action des rongeurs correspondraient à la consommation

humaine de 230 millions de personnes. Les pertes céréalières totales estimées seraient de

l'ordre de 10% de la production mondiale. Il faut de plus considérer ces animaux comme desquotesdbs_dbs41.pdfusesText_41

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