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Cours de culture cellulaire

1

ère

année Master Biochimie

Présenté par : Dr. AOUACHRIA Sana

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE ET DE BIOCHIMIE

Sommaire

Chapitre 1

1. Notion de base d"un laboratoire de culture cel

1.1. Généralités ......................................................................................................................................... 2

1.2. Règles de base ................................................................................................................................... 2

1.2.1. Ce qu'il faut faire ....................................................................................................................... 2

1.2.2. Ce qu'il ne faut pas faire ............................................................................................................ 4

1.3. Fonctionnement et entretien de l'équipement ................................................................................... 5

1.3.1. Hottes ......................................................................................................................................... 5

1.3.2. Incubateurs ................................................................................................................................. 7

1.4. Autres équipements ..........................................................................................................................10

1.5. Vaisselle de culture

1.6. Matériel de culture ...........................................................................................................................10

1.7. Milieux ............................................................................................................................................10

1.7.1. Volume de milieu ......................................................................................................................11

1.7.2. Stockage du milieu ....................................................................................................................11

1.7.3. Problèmes liés à la glut

amine ....................................................................................................11

1.7.4. Concentration de glucose ..........................................................................................................12

1.7.5. Effet du pH ................................................................................................................................12

1.7.6. Effet de la lumière .....................................................................................................................12

1.7.7. Effet de l'oxygène .....................................................................................................................13

1.7.8. Sérum ........................................................................................................................................13

1.7.9. Antibiotiques .............................................................................................................................13

1.7.10. Trypsine ...................................................................................................................................14

1.8. Contaminations .................................................................................................................................14

1.8.1. Origines des contaminations .....................................................................................................14

1.8.2. Types de contaminations ...........................................................................................................16

1.8.3. Traitements ................................................................................................................................17

1.9. Cross-contamination .........................................................................................................................18

Références bibliographiques........................................................................................19

Chapitre 2

2. Techniqu

es générales de culture cellulaire....................................................................21

2.1. Types de cellules cultivés

2.2. Obtention des cellules ......................................................................................................................22

2.2.1. Culture primaire ........................................................................................................................22

2.2.2. Culture secondaire (repiquage)..................................................................................................24

Figure 3. Culture secondaire (repiquage). ...........................................................................................24

2.2.3. Acheter ou emprunter ................................................................................................................24

2.3. Méthodes de culture .........................................................................................................................25

2.3.1. Culture stationnaire ou monocouche .........................................................................................25

2.3.2. Cultures en suspension ..............................................................................................................25

2.4. Condition de culture .........................................................................................................................26

2.4.1. Température ...............................................................................................................................26

2.4.2. Substrat et facteurs d'adhérence

2.4.3. Milieu de culture .......................................................................................................................27

2.5. Contrôles fonctionnels des cellules en culture .................................................................................28

2.5.1. Contrôles lors de la mise en route d'une culture ........................................................................29

2.5.2. Contrôles de routine ..................................................................................................................29

2.5.3. Les techniques d'entretien .........................................................................................................30

2.6. Croissance et évolution des cellules en culture

2.7. Cryoconservation

Références bibliographiques........................................................................................32

Chapitre 3

3. Techniques spéciales de culture cellulaire.....................................................................34

3.1. Méthode d'études de la viabilité cellulaire .......................................................................................34

3.1.1. Approches morphologiques .......................................................................................................34

3.1.2. Méthodes de quantification de la viabilité cellulaire .................................................................35

3.2. Quantification des cellules mortes par la perte d'intégrité de la membrane plasmique ...................37

3.2.1. Méthodes utilisant l'exclusion de colorants vitaux ...................................................................37

3.2.2. Méthodes utilisant la libération

d'enzyme intracellulaire .........................................................38

3.3. Détection couplée des cellules mortes et des cellule

s vivantes

3.4. Méthodes d'étude de la prolifération cellulaire ................................................................................39

3.4.1. Dénombrement des cellules .......................................................................................................40

3.4.2. Quantification des acides nucléiques .........................................................................................40

3.5. Etude du cycle cellulaire ..................................................................................................................41

3.6. Méthodes d

'étude de la génotoxicité (test de comètes) ....................................................................41

Références bibliographiques........................................................................................43

Chapitre 4

4. Lignées cellulaires............................................................................................................45

4.1. Cultures primaires ............................................................................................................................45

4.1.1. Avantages ..................................................................................................................................45

4.1.2. Inconvénients .............................................................................................................................45

4.2. Cellules immortaliséee

46

4.2.1. Avantages ..................................................................................................................................47

4.2.2. Inconvénients .............................................................................................................................48

4.3. Cellules tumorales ............................................................................................................................49

4.3.1. Avantages ..................................................................................................................................49

4.3.2. Inconvénients .............................................................................................................................49

Références bibliographiques........................................................................................51

Chapitre 5

5. Applications de la cul

ture cellulaire............................................................................53

5.1. Systèmes de modèles ........................................................................................................................53

5.2. Tests de toxicité ................................................................................................................................53

5.3. Recherche sur le cancer ....................................................................................................................53

5.4. Virologie ...........................................................................................................................................53

5.5. La cellule comme usine de production .............................................................................................54

5.6. Génie génétique ................................................................................................................................54

Références bibliographiques........................................................................................55

1

Avant-propos

Le présent polycopié est le support écrit du module "culture cellulaire" destinés aux étudiants du

Master 1 Biochimie Appliquée. Les cours de ce module ont pour but d"acquérir les bases théoriques et pratiques de la culture cellulaire animale ainsi que les notions de base relative à la

biologie des cellules en culture. De plus, Ils apportent une initiation dans la pratique de la culture

des cellules animales.

Le présent

polycopié est conçu suivant le canevas officiel prescrit par le ministère de l"enseignement supérieur et de la recherche scientifique. Ces cours sont organisés en cinq chapitres 1. En premier lieu sont présentées des règles de base pour la culture de cellulaire. En outre, les différents équipements sont évoqués ainsi que les milieux de culture et le problème des contaminations. 2. En second chapitre sont présentées les méthodes d"obtention des cellules à partir des tissus. Ce chapitre présente aussi les types et les conditions de culture, les contrôles des cellules en culture. Enfin, il traite la méthode de cryoconservation. 3.

Le troisième chapitre est consacré à l"étude de différentes techniques spéciales de la

culture cellulaire. 4. Le quatrième chapitre présente les types de lignées cellulaires en citant les avantages et les inconvénients pour chacune. 5. Le dernier chapitre expose les applications de la culture cellulaire. Notions de base d'un laboratoire de culture cellulaire 2

1. Notion de base d'un laboratoire de culture cellulair

e

1.1. Généralités

En plus des risques de sécurité communs à la plupart des lieux de travail quotidiens, un laboratoire de culture cellulaire présente un certain nombre de risques spéc ifiques liés à la manipulation et à la manipulation de cellules et de tissus humains ou animaux, ainsi que de solvants et de réactifs toxiques, corrosifs ou mutagènes.

L'objectif fondamental de tout programme de biosécurité est de réduire ou d'éliminer l'exposition

des travailleurs de laboratoire et de l'environnement extérieur à des agents biologiques

potentiellement nocifs. L'élément le plus important de la sécurité dans un laboratoire de culture

cellulaire est le strict respect des pratiques et techniques microbiologiques standard. La distinction entre un laboratoire dit classique et une salle de culture est le fait que dans une salle de culture, il faut maintenir un degré d'asepsie.

1.2. Règles de base

La contamination en culture

cellulaire par des microorganismes et la cross-contamination sont des problèmes majeurs en culture cellulaire Les contaminants (bactéries, levures, champignons, mycoplasmes...) sont introduits par :

l'opérateur, l'atmosphère, la surface de travail, les solutions utilisées et bien d'autres sources.

Des techniques d'asepsie permettent d'éliminer de telles contaminations.

Il faut donc établir des règles de conduite strictes dans les salles de culture surtout si beaucoup de

personnes sont susceptibles d'utiliser le même espace de travail.

En effet, si les règles ne sont pas respectées, la contamination qui est partie d'une ou de deux

cultures, peut s'étendre à plusieurs lignées, voire à tout le stock de lignées

1.2.1. Ce qu'il faut faire

1.2.1.1. Hygiène personnelle

Se laver les mains en entrant dans la salle de culture. Porter des habits de protection : blouse, gants (ne pas mettre la mêmeblouse pour le labo et la salle de culture). Jeter les gants si on a manipulé des cultures contaminées. Jeter les gants si le travail en culture est terminé. Notions de base d'un laboratoire de culture cellulaire 3

Remarque

Ne pas nettoyer les

gants de protection à l'alcool ; cela les rend poreux et donc inefficace.

1.2.1.2. Culture

Nettoyer la surface de travail de la hotte à l'éthanol à 70% avant de commencer à travailler Ranger la surface de travail : pas de matériel inutile sous la hotte (si trop de matériel se trouve sous la hotte, on risque de toucher du matériel non stérile avec par exemple des tips, des pipettes, ou des pipettes Pasteur stériles). Il faut bien suivre le mouvement de chaque geste pour éviter de toucher du matériel non stérile. Garder un espace "clair" au centre du plan de travail En sortant les flacons de l'incubateur, fermer les bouchons le plus rapidement possible. Ne mettre sous la hotte que des boîtes de cellules propres (les nettoyer avec du papier absorbant et de l'éthanol à 70%)

Si vous renversez du milieu ou des cellules, éponger immédiatement et désinfectez avec de l'éthanol à 70% et vérifier à la fin de la manipulation, si le fond de la hotte est sale. Si

oui, il est impératif de procéder à un nettoyage à fond.

Manipuler une lignée cellulaire à la fois : on réduit le risque de cross-contamination ou de

contaminations dues à la formation d'aérosols. Eviter de laisser les flacons de milieux ou de cellules ouverts sous la hotte.

Désinfecter le plan de travail avec de l'éthanol à 70% entre les différentes opérations.

Re-désinfecter le matériel et le plan de travail avec de l'éthanol à 70% et sécher avec du

papier absorbant après avoir terminé le travail de culture.

Vérifier les cultures régulièrement ainsi que les milieux pour détecter les contaminations bactériennes, de champignons ou de levures.

En cas de contaminations, changer les plateaux métalliques sur lesquels se trouvent les boîtes de cellules : autoclaver les plateaux sales et utiliser des plateaux stériles (ne jamais

poser les boites de Pétri directement sur le plateau de l'incubateur).

Tester les mycoplasmes en cas de suspicion.

Notions de base d'un laboratoire de culture cellulaire 4 Bien observer les cultures " importées " d'autres laboratoires : elles comportent le risque d'avoir été contaminées soit par le labo d'origine, soit pendant le transport. Ne pas les mélanger avec d'autres cellules.

1.2.1.3. Milieux et réactifs

Nettoyer l'extérieur des bouteilles à l'éthanol à 70% avant de les poser sous la hotte. Etre très attentif si on utilise la même bouteille de milieux pour plusieurs lignées. Après ouverture de la bouteille de milieu, il faut reposer le bouchon sur la bouteille dès que possible. Les bouchons doivent être posés à l'envers sur la paillasse derrière la bouteille pour éviter de les toucher.

1.2.1.4. Equipements

Nettoyer régulièrement hottes, incubateurs, centrifugeuses, réfrigérateurs, microscopes, bain -marie ...

1.2.2. Ce qu"il ne faut pas faire

1.2.2.1. Hygiène personnelle

Ne pas se moucher.

Ne pas tousser devant la hotte. En cas de besoin (rhume par exemple), mettre un masque.

Si on veut parler, il faut veiller à ce qu'il y ait effectivement une barrière entre vous et la

culture (vitre de la hotte à flux laminaire) Ne pas circuler inutilement dans la pièce de culture : cela crée de la poussière.

1.2.2.2. Culture

Ne pas faire de mouvements brusques sous la hotte qui perturbent le flux sous la hotte. Les mouvements lents permettent à l'air de circuler normalement.

Ne pas faire de gestes inutiles.

Ne pas manipuler au-dessus d'un flacon de cellules ouvert ou d'une bouteille de milieu ouverte. Ne pas accumuler trop de matériel sous la hotte.

Ne pas laisser de liquides sous la hotte à flux laminaire en raison de la formation d'aérosols.

Ne pas être trop nombreux dans la pièce de culture. Notions de base d'un laboratoire de culture cellulaire 5 Ne pas garder les cellules trop longtemps en culture sans re-décongeler du stock d'origine.

1.2.2.3. Milieux

Ne pas utiliser la même bouteille de milieu par plusieurs personnes Ne pas stocker les milieux de culture trop longtemps dans les frigos : la durée de conservation d'un milieu contenant de la glutamine et du sérum ne doit pas excéder 6 semaines. C'est pourquoi, il faut calculer au plus juste les quantités de milieux commandés auprès du service de culture. 1.2 .2.4. Matériel Ne pas stocker des cartons dans la pièce de culture : ils sont source de poussière et donc de contaminations.

1.3. Fonctionnement et entretien de l"équipement

Les exigences spécifiques d'un laboratoire de culture cellulaire dépendent principalement du

type de recherche effectuée. Par exemple, les besoins d'un laboratoire spécialisé en culture de

cellules mammifères pour la recherche sur le cancer sont assez différents de ceux d'un laboratoire de culture de cellules d'insecte s qui se concentre sur l'expression des protéines. Cependant, tous les laboratoires de culture cellulaire ont pour exigence commune d'être exempts de microorganismes pathogènes (c'est-à-dire d'asepsie) et partagent certains des mêmes

équipements de base indispensables à la

culture de cellules. 1 .3.1. Hottes

1.3.1.1. Définition

Le meilleur moyen pour travailler stérilement est d'utiliser une hotte à flux laminaire. Le

principe physique est d'obtenir une laminarité des filets d'air filtrés, ceux-ci devant s'écouler en

filets rectilignes, parallèles, verticaux de même vitesse et même sens. On obtient ainsi un apport

d'air filtré sur le plan de travail. L'ensemble du volume de travail est balayé d'une façon parfaitement laminaire et donc homogène par de l'air filtré. Le flux lami naire crée un bouclier qui interdit aux particules extérieures d'entrer dans l'enceinte.

1.3.1.2.

Types de hottes

Hotte de type I (figure 1) : la manipulation est parfaitement protégée par les flux d'air qui l'enrobent. Ce type d'appareil dirige un flux laminaire vertical à travers un filtre absolu (High- Efficiency Particulate Air, HEPA). En revanche, le manipulateur n'est pas protégé Notions de base d'un laboratoire de culture cellulaire 6 car une partie du flux d'air vertical (20%) sort de l'enceinte à l'avant de la hotte mais

80% sont recyclés.

Figure 1. Hotte à flux laminaire vertical HEPA. Hotte de type II ou poste de sécurité microbiologique (PSM) (figure 2) : la manipulation, le produit et l'environnement sont parfaitement protégés. Le flux d'air est repris par la base du panneau arrière pour recyclage (70%) et évacuation vers l'extérieur (30%) après passage par un filtre HEPA sur le haut de la hotte. La protection de l'environnement est une assurée par un filtre absolu placé sur la sortie en partie haute et celle du manipulateur par un flux d'air entrant en façade avant qui compense celui rejeté à l'extérieur. Figure 2. Hotte de type II ou poste de sécurité microbiologique (PSM).

Ventilateur

Prise de

l'air Air d'échappement

Filtres principales

HEPA

Pré-Filtres

Filtration

Notions de base d'un laboratoire de culture cellulaire 7

Pour l'utilisation de

matériel à risque (lignées cellulaires de primates et d'humains, lignées produisant des virus), il faut utiliser des hottes PSM de type II.

Il ne faut rien poser sur les grilles se trouvant à l'entrée de la hotte, ni boucher les grilles se

trouvant à l'arrière de manière à ne pas perturber le flux d'air.

1.3.1.3. Entretien

Le plan de travail doit être propre et rangé de manière à ne pas perturber le flux d'air.

Il faut nettoyer le plan de travail avec de l'éthanol à 70% avant et après chaque manipulation. Ne jamais utiliser d'eau de javel. Tout matériel disposé sous la hotte doit être propre. Il faut enlever les plateaux de la hotte 1X/ semaine et bien nettoyer le fond de la hotte (détergent 7X, eau, puis éthanol à 70%). En fin de journée, on peut installer les UV ou laisser fonctionner la hotte en ½ vitesse (suivant la position des UV, ils n'atteignent pas toujours toutes les parties de la hotte d'où l'intérêt du fonctionnement en ½ vitesse). Les filtres des hottes sont vérifiés 1X/ an.quotesdbs_dbs50.pdfusesText_50

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