[PDF] RESPIRATOIRE DE SACCHAROMYCES CEREVZSZAE

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COMPLEMENTATION ENTRE MUTANTS A DEFICIENCE

RESPIRATOIRE DE

SACCHAROMYCES CEREVZSZAE: ETABLISSEMENT

ET REGULATION DE LA RESPIRATION DANS LES ZYGOTES

ET DANS LEUR PROCHE DESCENDANCE

HEDWIG JAKOB

Laboraioire de G6n6tique Physiologique du CNRS, Gif-sur-Yvette (Seine et Oise), Frame

Received January 22, 1965

U cows de leurs recherches sur les mutants 21 d&ficience respiratoire chez la A levure, EPHRUSSI et ses collaborateurs (1949-1955) ont pu ktablir que la synthkse des enzymes respiratoires est sous le contr6le B la fois de gknes mend&- liens et d'un facteur cytoplasmique. La dkficience respiratoire peut &tre provoquke soit par la mutation d'un seul gkne, soit par la perte ou l'inactivation du facteur cytoplasmique. On connait deux classes de mutants

21 dkficience respiratoire:

(1 ) les mutants chromosomiques ou "petites skgrkgantes" ( CHEN, EPHRUSSI et HOTTINGUER 1950; SHERMAN 1963; SHERMAN et SLONIMSKI 1964) chez lesquels la dkficience est due

B la presence d'un

seul gkne rkcessif; (2) les mutants cyto- plasmiques ou "petites vkgktatives" qui presentent une hkrkditk non menddienne (EPHRUSSI et collaborateurs, 1949; WRIGHT et LEDERBERG 1957) oh les dkfi- ciences, toujours multienzymatiques ( SLONIMSKI 1953), sont attribukes B la perte ou B l'inactivation du facteur cytoplasmique. D'aprks leur comportement dans le croisement avec une levure B respiration normale ces derniers mutants peuvent &re class& en deux categories: les "petites suppressives" imposant le caractkre de "petite" aux zygotes et B leur descendance vkgktative et les "petites neutres" donnant des zygotes b descendance vegktative presque exclusivement composke de cellules b respiration normale ( EPHRUSSI, HOTTINGUER et ROMAN 1954). Alors que le croisement entre deux mutants cytoplasmiques neutres conduit toujours B la formation de zygotes "petites," dont la descendance vegktative est entikrement composke de cellules "petites," le croisement soit entre un mutant chromosomique et un mutant cytoplasmique neutre, soit entre deux mutants chromosomiques non allkliques conduit

B la formation de zygotes dont la grande

majorith donne une descendance vkgktative composke de cellules "grandes," capa- bles de synthktiser les enzymes respiratoires. On en a infkrk que, en l'absence du g4ne dominant, le facteur cytoplasmique prksent chez les mutants chromo- somiques demeure "inactif." L'expression de la fonction respiratoire peut btre suivie dks la rkunion dans une m&me cellule, le zygote, des dkterminants genktiques requis pour la synthkse normale des enzymes respiratoires. L'ktablissement de la respiration peut Gtre ktudik dans les zygotes, immkdiatement apr4s leur formation et dans leur proche

descendance vegktative. Cette etude prksente un intkret tout particulier pour Genetics 52 : 75-98 July 1965

76 H. JAKOB

comprendre comment le systhme respiratoire, non fonctionnel dans les deux cellules parentales, peut devenir fonctionnel dans les cellules issues de leur fusion. L'objet du prdsent travail est de ddterminer quelques unes des relations entre les divers gknes mutds et le facteur cytoplasmique, et l'influence de ces ghes et des eff ets biochimiques qu'entraine leur mutation, sur

IPS mdcanismes impliqub

dans le ddveloppement de la fonction respiratoire.

MATERIEL ET TECHNIQUES

Lktude de l'ktablissement de la respiration dans les croisements entre deux mutants capables de se complkmenter a ktk effectuke, suivant le schkma expkrimental type represent6 dans la figure

1. Elle porte sur des zygotes (form& en un temps court, au plus kgal A 1,5 heures)

immkdiatement aprks leur formation (temps zkro, to) et pendant 20 heures sur leur proche descendance (A des intervalles de temps de 2 heures) .

1. Nomenclature: Les abrbviations suivantes seront utiliskes:

"G": cellules "grandes," normales du point de vue des enzymes respiratoires. c.f.c.: Nombre de cellules ou de groupes de cellules formant une colonie.

Temps de latence

"TL 250" : Temps en heures Qcoulk depuis la formation des zygotes pour que la vitesse de respiration aux dkpens de l'kthanol atteigne 250 pl O,/heure/l08 c.f.c. "grandes". (Consommation do, mesurke dans l'appareil de Warburg pendant l'adaptation respiratoire, en l'absence de source exogkne d'azote, entre la quatrikme et la sixikme heure) La nomenclature et les symboles que nous utiliserons sont ceux adoptks par SHERMAN et

EPHRUSSI (1962).

P et p dksignent respectivement gene sauvage dominant et son allkle rkcessif mutQ. p+ et p- dksignent la prksence ou 1I"absence" du facteur cytoplasmique. p-, indique que le mutant cytoplasmique est neutre (EPHRUSSI, HOITINGUER et ROMAN 1955;

EPHRUSSI et GRANDCHAMP 1965). Les mutants

p- utilisks dans ce travail ktaient tous neutres, c'est-A-dire que le croisement avec une souche

Pp + donne une descendance dipldde entikrement

composke de cellules normales du point de vue respiratoire. Dans ce qui suivra nous omettrons partout l'indice n. Les souches utiliskes appartiennent aux quatre types suivants ( CHEN, EPHRUSSI et HOTTINGUER

1950) : (a) Type sauvage, "grande": Pp+; (b) Mutants chromosomiques, "petites dgrkgantes":

pep+; (c) Mutants cytoplasmiques neutres, "petites vkgktatives": Pp-,; (d) Mutants doubles neutres, "petites doubles": pzp-,.

2. Souches: Les croisements ont toujours ktk effectuds entre des souches haploi'des et auxo-

trophes. Les mutants chromosomiques proviennent,

B l'origine, des souches isolkes par CHEN et

par PITTMAN. Les gknes ont ktk ktudiks par HAWTHORNE et MORTIMER (1960) et par SHERMAN (1963). La nomenclature utilisPe est celle de cx deriers auteurs.

Mutants cytoplasmiques neutres:

C-982-19 dA,

55R-5-3C-11

a Pp- ur

Mutants chromosomiques:

1275-2B

H.J.11-5A-3/3

D.243-2B-5/3

H.J.18-1A

SG2-IC

H.J.22-26C

CY Pp- tr, hi,

a pip+ ad, (provenant de D. HAWTHORNE) CY p,p+ ad, hi, (provenant d'un croisement de la souche prkckdente). a p,p+ ad, ly, (provenant de F. SHERMAN)

01 p,p+ hi, (provenant d'un croisement de la souche prkckdente).

ap,p+ ad, ly, (provenant d'un croisement de la souche F. SHERMAN,

D213-9B).

01 psp7p+ hi, (provenant d'un croisement des sourches H.J.18-1A et

SG2-IC.)

Au cours de la multiplication vkgktative des souches de "petites skgregantes", des "petites doubles" (p,p-) prennent twjours naissance. Lors du croisement avec une cellula PP-, les cellules de type pip- forment d-s zygotes B descmdance cntikrement "pct.tes". I1 dtait important pour

COMPLiMENTATION ENTRE "PETITES" 77

notre ktude de travailler avec des souches de "petites s6grkgantes" contenant peu de cellules p,p-. Far sous-clonage des souches originales nous avons isalk des clones des mutants p5p+ et p7p+ contenant environ 5 A 30% de cellules p+p-. I1 n'a pas etk possible d'isoler une souche p,p+ contenant une proportion de "petites doubles" (p,p-) inferieure A 70%. "Petites doubles" neutres: Toutes les "petites duubles" sont des mutants spontanks issus par multiplication vkgktative des mutants chromosomiques enumkres ci-dessus: ils n'en diffkrent du point de vue gknktique, que par le caractkre p-. Toutes ces "petites" sont neutres et ont ktk choisies parmi de nombreux clones p- isolks:

H.J.11-5A-3/3-15

(Y p,p- ad, hi,

D.243-2B-5/3-a a p7p-ad, ly,

H.J. 18-1 A-a

SG2-IC-1

a P~P- ad, IY,

1275-2B-13 a PIP- ad,

(Y p7p- hi, Souches diplozdes: Ces souches sont issues du croisement entre deux mutants capables de se complkmenter. Elks ne diffh-ent des souches que nous ktudierons plus loin que par le grand nombre de gknerations cellulaires effectuees depuis la formation des zygotes. Elks sont proto- trophes et nxmales du point de vue des enzymes respiratoires ("grandes") H.J.17 issue du croisement entre SG2-IC et C-982-19dAI (a/a; p5/P; p+; ad,/+; ly,/+; tr,/+; hi,/+). H.J.18 issue du croisement entre D-243-2B-5/3 et C982-l9dA1 (a/.; p7/P; p+; ad,/+; be/+; tr,/+: hi,/+).

3. Composition des milieux de culture:

Milieux complets:

YPG: yeast extract Difco 10 g; Bacto-peptone Difco 10 g; glucose 20 g; eau distillee, 1000 ml.

YPGA: milieu prkckdent additionnk de

40 mg/l de sulfate d'adknine.

Ye

3%: yeast extract Difco 5 g; glucose 30 g; eau distillke 1000 ml.

3 S: yeast extract Difco log; PO,H,K, 1 g; S04(NH4)Z, 1,2g; glucose, 60 g; eau distillee

3 S+E: milieu preckdent additionnk de 1% d'une solution d'ergostbrol-Tween (250 mg

1000 ml.

d'ergostkrol + 25 ml de "Tween 80" + 75 ml d'ethanol). Milieu minimal Go (selon GALZY et SLONIMSKI, 1957) : SO,Mg-,. 0,5 g; SO,(NH,)*, 2,O g; PO,H,K, 1,0 g; PO,H,NH,, 6,O g; ClNa,O,l g; Cl,Ca, 0,1 g; pantothenate de Ca, 0,002 g; thiamine, 0,002 g; inositol, 0,002 g; pyridoxine, 0,002 g; acide nicotinique, 0,0005 g; biotine,

0,00002 g; chlorure ferrique, 0,002 g; eau distillke 1000 ml.

Ce milieu de base a ktk utilisk pour la prkparation des milieux: Go

3%: additionnk de 3% de glucose,

G3D: additionnk

de 0,25% de glucose et de 2% (v/v) de glycerol,

GoGly: additionnk de

2% (v/v) de glyckrol.

Les milieux ont tous ktk gelosks

A 2%.

4. Tempdrature de culture: Les croisements et les cultures en milieu liquide ont toujours kt6

effectuks B 25°C; les cultures sur milieu gklosk A 30°C. 5. Croisemenfs: Les croisements ont ktk effectues selon la technique de formation des zygotes synchrcnes (JAKOB 1962) 1kgPremmt modifike. Au lieu d'utilker ds cultures ayant atteint la phase stationnaire de croissance, nous avons toujours croisk des cellules provenant de cultures (milieu YPG) en phase logarithmique (ayant attzint une densitk de

4 x 10' cellules/ml). En

effet, dans les cultures de mutants chromosomiqux pip+ apparaissent toujours des mutants rkverses PP+ prksentant, en phasz stationnaire de croissance, un fort avantage dlectif; la prksence de tels mutants, normaux du p3int de vue d- la res?iration, est g&nsnte pzur notre ktude. Les croisements (6 X IO' cellules/ml de chacune des deux souches parentales) ont ktk effectues en milieu Ye

3% en fioles dErlenmeyer de 6 litres contenant 600 ml de milieu. Les cellules ont

ktk centrifugkes

2 heures aprks le mklange des souchcs parentales puis, 30 minutes plus tard, le

milieu a Ctk renouvelk. Les zygotes ont Cte rkcoltks une heure et demie aprks ce traitement soit quatre heures aprks le mklange des dcux souches parentales. A ce moment, le mblange de copulation ccntient envirzn 1 A 5% d. zygot-s (% d5tennink pnr compt-g: d'rect). Les fusions

78 H. JAKOB

Croisement @air 5)

lavage i 00

Zygotes synchrones

Suspension en milieu minimal

glu'cosi temps ziro

Temps Oheures Temps 2heures Temps 4heures

lavage i O! lavage a 0' FIGURE 1.-Schkma experimental type. Deux souchs "petites" capables de se complkmenter, haplo'ides, auxotrophes, de signe a et (Y respectivement sont croiskes. Les zygotes diploides, "grandes" prototrophes, rbultant du croisement sont ensemencks en milieu minimal glucose oh ils se multiplient. Le dknombrement des types cellulaires prksents dans la culture et l'ktude de leur respiration est effectuk h intervalles rkguliers, (voir 5 etc . . .) . Voir MAT~IEL et TECHNIQUES, paragraphe 5. ultkrieures entre cellules des types parentaux sont arr6tkes par refroidissement dans la glace et lavage du melange de copulation

1 l'eau glacke. La grande majoritk des zygotes Qtudibs sont formks

de faGon synchrone, la plupart des fusions se produisant entre la troisihme et la quatrihme heure.

11s constituent les kchantillons du "temps zkro"

(to) de toutes nos expkriences.

COMPL~MENTATION ENTRE "PETITES" 79

6. Multiplication ue'ge'tatiue des zygotes: Les croisements ont toujours ktk effectuks entre

deux souches haploi'des auxotrophes, de signes oppos&, marquees par des dkficiences biochimiques recessives differentes, les zygotes ktudiks ktant ainsi toujours prototrophes. Au "temps z6ro" le melange de copulation est ensemenck dans le milieu minimal glucosk

Go 3% (densitk initiale

en zygotes 1.5 B 2 x lO5/ml), dans lequel sds les zygotes et les cellules qui en sont issues se multiplient. Nous avons vkrifik par des comptages directs au microscope et par Ctalement que, dans ce milieu minimal, les cellules auxotrophes des types parentaux ne sont plus capables de fusionner pour former de nouveaux zyg3tes et qu'elles se divisent au maximum une fois. Les cultures sont aerCes A 25". Des kchantillons sont prklevks B d2s temps variables entre zero et 24 heures (figure 1). Toutes les experiences ont et6 exkcutees selon ce schema. (Dam quelques experiences les cultures ont et6 conservees dans la glace pendmt la nuit puis, rkchauffees rapide- ment b 25" avant d'6tre remises en culture akrke. Nous avons vCrifi6 que ce procPd6 ne modifiait ni la vitesse de croissance, ni les mzsures manzimetriques dkcrites ci-dessous).

7. Cultures en conditions d'androbiose: Quelques cultures de souches "grandes" prototrophes

ont ktk effectukes selon la technique dkcrite par

SHORTMAN et FUKUHARA (1963). Aprhs 20

divisions cellulaires environ, en anaerobiase, les cellules ont kte lavkes rapidement a 0°C. Elles

ont ete ensuite ktudikes dans les m@mes conditions de culture (milieu

Go 3% adrk) que les

zygotes.

8. Etalement sur milieux gklose's: de'nombrement des diffkrents types de colonies. Tous les

Cchantillons etudiks ont ktk ktales

B la surface de differents milieux gClo&s. Ces milieux per- mettent de connaitre d'une part, le nombre total de cellules, qu'elles soient auxotrophes ou prototrophes (milieux complets) et d'autre part, celui des cellules prototrophes (milieu minimal). Sachant par ailleurs, que seules les cellules normales du point de vue respiratoire sont capables de croitre aux dkpens du glyckrol comme seule source carbonke, nous pouvons connaitre le nombre de cellules "grandes" et "petites". Nous avons determink pour chacun des Cchantillons le nombre de cellules ou plus exactement de groups de cellules formant une colonie, c.f.c., aprhs ktalement sur les milieux suivants: (a) GoGly, contenant comme seule source carbonke le glyckrol. Seules les cellules prototrophes, normales du point de vue respiratoire au moment de l'ktalement, forment une colonie. (b) GOD contenant du glyckrol et une faible quantite de glucose. Toutes les cellules proto- trophes, qu'elles soient ou non pourvues des enzymes respiratoires au moment de l'e'talement: peuvent croitre aux dkpens du glucose. On demmbre sur ce milieu, dune part des colonies de petite taille provenant de cellules prototrophes gknotypiquement "petites", d'autre part des colonies de grande taille. Une partie de ces dernihres colonies peut provenir de cellules phenoty- piquement "petites" au moment de l'ktalement mais gknotypiquement "grandes". Ces cellules peuvent acquerir, au cours du dkveloppement des colonies, la capacite respiratoire et croitre alors aux dkpens du glycerol pour former une colonie de grande taille. I1 peut en rksulter une dis- cordance entre le nombre de c.f.c. "grandes" prototrophes determine sur les deux milieux GoGly et GOD, discordance qui fixe, a chaque moment, le phknotype des cellules B genotype "grande".

Ainsi, dans l'exemple consign6 dans le tableau

1, les kchantillons prklevb aux temps "to" et "tZ"

prksentent cette discordance alors qu'au temps "t6" elle n'existe plus: genotype et phenotype sont alors, au moment de l'ktalement, ceux d'une cellule "grande". (C) YPG: milieu complet glucos6. Toutes les cellules qu'elles soient auxotrophes ou proto- trophes croissent sur ce milieu. (d) YPGly: milieu complet ne contenant que du glyckrol; toutes les cellules "grandes" qu'elles soient prototrophes ou auxotrophes forment une colonie. L'6talement sur ce milieu permet de contr6ler l'absence dans la culture, de mutations reverses du type pzp+ U Pp+. Si de telles muta- tions s'kaient produites avec une frkquence apprkciable on devrait trouver ici un nombre plus Cleve de colonies "grandes" que sur le milieu GOD ("grandes" prototrophes). Dans les cultures parentales (toujours Ctalees sur ce milleu) la frequence des mutants &verses ktait toujours infkrieure

B 1 pour 105.

Les comptages sur les deux milieux glucoses GOD et

YPG ont toujours ktP faits aprhs colora-

tion au chlorure de tetrazolium (OGUR, ST. JOHN et NAGAI 1957). Toutes les colonies colorables sont classies parmi les "grandes". Les comptages ont port6 sur environ 400 colonies et ont ete

80 H. JAKOB

TABLEAU 1

Nombre de colonies (c.f.c.) x 108 "grand&' et "petites" dknombries sur les difjkrents milieux. Croisement p7p+ x plp-

Prototrophes Auxotrophes et prototrophes

GoGly

GOD YPGly YPG Temps Pcoule depuis la formation des zygotes "grandes" "grandes" "petites" "wandes" "grandes" "petites"

Les Bchantillons sont preleves dans le milieu de culture Go 3% et laves deux fois 1 l'eau avant l'&talenient. Les valeurs exkrimentales n'ont

pu 6tre dkterminkes qu'ik 10% prh. effectuks aprh 4 jours de croissance sur les milieux glucosks et aprhs 5 jours sur les milieux contenant uniquement du glydrol. Nous avons choisi come unitk de rkfkrence la colonie ou le c.f.c. bien que cette unit6 puisse ne pas correspondre, B tout moment, au nombre de cellules du type considfir6 effectivement prksent dans la culture (voir ci dessus). Cependant un contrijle microscopique direct permet de vkrifier que, dans les diffkrents croisements, la plupart des zygotes se trouvent isdks au milieu de "grappes" de cellules haploides et que les colonies se dkveloppent, en gknkral,

B partir d'un seul

zygote. De meme, on peut verifier par comptage direct que les cellules diplo'ides, provenant de la division des zygotes sont en gknkral seules ou associkes par deux. I1 n'y a pas formation de gros groupes au cours de leur multiplication vkgktative. Au cours du temps le rapport entre nombre de c.f.c. et nombre de cellules comptkes directement reste constant. Les valeurs obtenues ont toujours ktk cgmparkes entre elles et les erreurs systkmatiques, dues B l'unitk de rkfkrence, sont du meme ordre de grandeur pour les diffkrents croisements fitudibs. 9. Mesures manomktriques: Les mesures manomktriques ont ktk effectukes selon la methode de Warburg. Nous avons utilisk l'kthanol (2,5% v/v) comme seule source d'knergie. (Le glucose ne pouvait etre utilid comme s3urce d'knerg'e

B cause de la prksence dans les kchantillons

ktudiks de nombreuses cellules "petites" non fusionnkcs.

Ccs "petites" utilisent le glucos: par

fermmtation et les variations des taux de dkgagement d:

CO, faussxa'ent inkvitablement la

determination de la consommation d'O, due h respiration des zygotes (SLONIMSKI 1958)). Les mesures sont faites sur les cellules en l'absence de source d'azote exogkne, dans les conditions utiliskes habituellement pour l'ktude de l'adaptation respiratoire de cellules provenant de cultures en androbiose ( SLONIMSKI 1956). Les vitesses de la consommation 80, ont ktk dkterminkes sur une suspension de cellules dans du tampon phosphate/phtalate/succinate 0,l M B pH 4,3 dans les conditions oh la constante d'absorption de premier ordre du CO, est d'environ de 0,8 min-1 (SLONIMSKI 1958). Les mesures ont toujours Qtk effectukes en double, pendant 6 heures, pour chacun des kchantillons ktudiks. Dans ces conditions de mesure il n'y a pas de changement notable du nombre d? c.f.c. entre le dkbut et la fin de la mesure. La plupart du temps les Bchantillons lavks ont ktk conserves

24 heures dans la glace avant la mesure. Ni mortalitk, ni changement de

vitesse de cons3mmation d'O, n'interviennent pendant ce temps.

RESULTATS

Les cindtiques d'apparition de la respiration dans les diffdrents croisements entre cellules "petites" capables de se compl6menter ont dtd ktudiees immddiate- ment apr& la formation des zygotes et aprhs des temps d'incubation croissants dans le milieu minimal glucosd (Go 3 % A titre d'exemple examinons les rksultats obtenus pour deux des croisements (figure 1 ) .

COMPL~MENTATION ENTRE "PETITES" 81

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