Quoi faire avec des résultats de qPCR
Genomic Platform. Institute of research in immunology and cancer University of Montreal www.genomique.iric.ca. 1. Quoi faire avec des résultats de qPCR.
Comprendre des résultats de qPCR
Qu'est-ce que le qPCR mesure? Si vous mesurez l'expression d'un gène le qPCR vous dira combien il y a d'un ARNm spécifique
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Par exemple les nanoparticules manufacturées d'oxydes de cérium Les résultats ont révélé que les Ce NMs sont biodisponibles pour C. reinhardtii mais et.
Nouvelles approches et concepts pour létude des communautés
Je voudrais maintenant remercier toutes les personnes que j'ai eu la chance de rencontrer et avec qui j'ai pu échanger au Genoscope en France.
Quoi faire avec des résultats de qPCR - IRIC
www genomique iric ca 1 Quoi faire avec des résultats de qPCR Qu’est-ce que le qPCR mesure? Si vous mesurez l’expression d’un gène le qPCR vous dira combien il y a d’un ARNm spécifique dans vos échantillons Vous amplifiez une région de l’ARNm avec des oligos et une sonde fluorescente
A PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA TAQMAN
1 Guide sur le PCR en temps réel (qPCR) Un service complet est offert par la plateforme de génomique de l’IRIC pour le qPCR incluant l’analyse de votre ARN la préparation de vos cDNA le design des essais la validation et l’analyse de vos résultats
A PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA TAQMAN - INRA
Représentation d’ amplifications par PCR de 5 dilutions d’un ADNc de référence L’axe des abscisses correspond aux cycles de la PCR L’axe des ordonnées correspond à la quantité du produit amplifié (échelle logaritmique) Pour chaque dilution deux courbes sont représentées correspondant à deux réplicats Nombres de cycles 0
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This document describes a qPCR method for quantifying sequencing by synthesis (SBS) libraries generated using the Illumina® sample preparation protocols and Eco™ Real?Time PCR System qPCR is a method of quantifying DNA based on PCR qPCR tracks target
LA PCR QUANTITATIVE (qPCR) POUR LA MESURE DE L’ABONDANCE DE
cours du diagnostic la qPCR permet de déterminer l’état microbiologique de cet environnement à travers l’analyse de groupes ou de taxons microbiens connus de gènes fonctionnels ou de leur expression Lors de la phase d’évaluation d’une possible mise en place de biotraitement la qPCR permet d’évaluer la présence d’un
Les nouveaux outils pour réussir la qPCR
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Qu'est-ce que la PCR quantitative en temps réel?
- LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA "TAQMAN" I- Terminologie Le terme TaqMan est souvent utilisé par abus de langage pour désigner : - la technique de PCR quantitative par détection en temps réel de la fluorescence - l'appareil 7700 de chez Perkin Elmer.
Qu'est-ce que la machine qPCR?
- La machine qPCR mesure l’intensité de fluorescence émise à chaque cycle PCR. Pendant les premiers cycles, il n’y a pas assez de fluorescence pour être détectée, mais rapidement la réaction produit de plus en plus d’amplicons et la courbe démarre.
Qu'est-ce que la courbe d'amplification d'une réaction de PCR?
- Figure 1 : Courbe d’amplification d’une réaction de PCR Représentation d’une amplification par PCR d’un fragment d’ADN. L’axe des abscisses correspond aux cycles de la PCR. L’axe des ordonnées correspond à la quantité du produit amplifié.
Quels sont les cycles d’un qPCR?
- Un qPCR comporte environ 40 cycles. Plus le Ct est élevé (30-35), moins l’ARNm détecté est présent, car il faut plus de cycles PCR pour Ct=22 Ct=24 Genomic Platform Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal www.genomique.iric.ca
Genomic Platform
Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal www.genomique.iric.ca 1Quoi faire avec des résultats de qPCR
être prise dans la phase exponentielle, là où la pente est linéaire. On place le seuil (ligne
rouge) dans cette phase, et le Ct se mesure là où la courbe PCR croise le seuil. Définitions des termes retrouvés dans le fichier excel de résultatsContrôle endogène
Le contrôle endogène est le gène qui ne varie pas entre les échantillons testés.Par exemple : GAPDH, ACTB, TBP, HPRT, PPIA, YWHAZ
Calibrateur
varie pas par rapport à lui-même.Ct = Cycle Threshold
Valeur à laquelle la courbe PCR croise le seuil. Un qPCR comporte environ 40 cycles. Plus le Ct=22 Ct=24Genomic Platform
Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal www.genomique.iric.ca 2fortement exprimé. Les contrôles endogènes ont souvent un Ct plus petit que les autres
gènes. Delta Ct = Ct gène ± Ct contrôle endogène Delta Delta Ct = ¨Ct échantillon1 ± ¨Ct calibrateurDelta Ct SD = Standard Deviation
Écart type calculé par le logiciel. Cette erreur reflète la qualité des triplicatas technique pour
le gène test et pour le gène endogène pour un même échantillon. Pour que la valeur soit
considérée comme valide, la SD doit se situer sous 0.25. Si la SD est au-dessus de 0.25, la valeur du RQ est alors considérée comme moins fiable.RQ = Relative quantification = 2-¨¨FP
échantillons ont une valeur par rapport à ce calibrateur. Nous considérons un résultat comme significatif lorsque le fold-change est de minimum deux, voulez observez un petit fold-change (1.5-2 fold), il vous faudra des échantillons parfaitementpropres, probablement faire des quadruplicata, penser à utiliser 2 essais pour le même gène,
et utiliser des contrôle positif avec des fold-change connus. de confiance place à 95%. Si vous voulez obtenir une vraie erreur biologique sur la valeur du RQ, vous aurez besoin de triplicata biologique. Ensuite, vous pouvez faire une moyenne des RQ ou des deltaCts destriplicatas. Si vous utilisez le 7900HT, le logiciel DataAssist peut le faire pour vous
(www.appliedbiosystems.com).Qualité générale des résultats
très prudent et assurez-vous que les répliquats sont beaux. Un DeltaCt SD<0.25 est bon. Cette erreur ne peut pas valider la valeur biologique valables statistiquement, il vous faut des répliquats biologiques. Si tous vos gènes sortent très tard (spécialement les contrôles endogènes), et queGenomic Platform
Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal www.genomique.iric.ca 3Analyse avec plusieurs contrôles endogènes
La plupart du temps, un seul contrôle endogène est utilisé. Mais utiliser 2 ou 3
contrôles endogènes est de plus en plus recommandé, et améliorera la précision de vos résultats. Simplement testez plusieurs contrôles et sélectionnez les gènes qui varient le moins entre les échantillons (le logiciel Genorm peut être utilisé pour cette endogènes est possible directement avec le logiciel de base. Si vous utilisez le7900HT, télécharger le logiciel DataAssist (www.appliedbiosystems.com), et importer
une analyse " Individual Cts ». Ce logiciel peut aussi faire une analyse avec vos répliquats biologiques et faire un T test entre les groupes. les résultats.The MIQE guidelines
The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22. Epub 2009 Feb 26Genomic Platform
Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal www.genomique.iric.ca 4Comment utiliser le logiciel SDS 2.2.2
Procurez-vous le logiciel SDS 2.2.2 disponible pour le téléchargement dans votre compte sur7900HT, le logiciel SDS 2.2.2 crée un fichier .sds avec les données brutes.
le logiciel).corrects. Vérifier si les contrôles endogènes sont bien identifiés dans la case " Task ».
Fermer le fichier.
3. Ouvrir un nouveau fichier : Relative Quantification (delta delta Ct) Study
4. En bas à droite, cliquer sur le bouton Add Plate et sélectionner le ou les fichier(s) .sds
correspondant(s).5. Cliquer sur la flèche verte.
courbes PCR.8. Pour visualiser un gène, sélectionner les puits correspondants, puis sélectionner le
9. Placer le Baseline en déplaçant la petite flèche rouge de droite en bas du graphique.
la première courbe commence.10. Déplacer le Seuil (ligne rouge) dans la section linéaire des courbes. Note : Le Baseline
11. Vérifier vos triplicata. Si vous voulez enlever un triplicata, sélectionner le puits,
faites attention quand vous faites des modifications car les sélections de puits sur différentes plaques se superposent. des Ct, cocher la case Individual ¨Cts.14. Dans le menu Fichier, sélectionner Export. Un fichier .txt sera produit.
Genomic Platform
Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal www.genomique.iric.ca 515. Ouvrir le fichier exporté avec excel.
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