[PDF] Système label-free xCELLigence Les techniques label-free

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Date : 01/06/2016

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Système label-free xCELLigence

Les techniques "label-free" permettent d'analyser de manière non invasive et en temps réel les processus cellulaires tels que l'adhésion, la migration, invasion et la prolifération cellulaire. Ces techniques permettent ainsi in vitro des cellules primaires issues de tissus o sur un organisme vivant marquer les cellules ou les protéines cibles avec, par exemple, des sondes fluorescentes. Parmi les techniques existantes, nous présenterons dans ce chapitre le système xCELLigence®, développé par ACEA Biosciences, qui est basé sur la mesure des changements impédance électrique au . La plateforme ARPEGE est un appareil xCELLigence RTCA DP (Real-Time Cell Analysis Dual Plate) qui permet d'analyser en temps réel, en continu et sans marquage l'adhésion, la prolifération, l'invasion et la migration des cellules ainsi que la toxicité et la signalisation cellulaire.

1) Principe du système xCELLigence.

Le principe du système xCELLigence repose sur la culture de cellules dans des puits tapissés d'électrodes en or1 recouvrant 70 à 80% de la surface totale des puits dune microplaque. Au sein de ce réseau s circule un courant alternatif de faible voltage (׽ microplaque joue le rôle électrolyte »2 en permettant au courant de circuler électrode3 à une autre comme illustré dans la Figure 1.

1 L'or est un très bon conducteur possédant une faible résistance. Il est chimiquement inerte et est compatible

dans des conditions physiologiques avec des modifications de surface (traitement de surface de type poly-L-

ornithine, poly-lysine, etc.).

2 Substance conductrice contenant des ions mobiles. Lorsqu'un courant électrique est appliqué entre des

électrodes immergées dans une solution conductrice, les ions de la solution se déplacent vers l'électrode dont la

charge est opposée à celles qu'ils portent. Un transfert d'électrons a lieu entre l'ion et l'électrode. Un ion négatif

cédera donc un électron à l'électrode chargée positivement (on parle d'oxydation) et un ion positif prendra un

électron à l'électrode chargée négativement (réduction). Le déplacement des ions se termine ainsi par une

réaction d'oxydoréduction impliquant les ions présents dans la solution.

3 Il est à noter que dans un circuit électrique les électrons se déplacent du pôle négatif vers le pôle positif mais

par convention le sens de circulation du courant est représenté dans le sens opposé.

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Figure 1. Illustration puits permettant la mesure de la variation d . Lorsque des cellules sont déposées dans les puits, elles vont progressivement adhérer au fond du support4. La présence de cellules sur les électrodes va avoir pour localement l'environnement ionique (à l'interface électrodes/solution)

Figure 1).

2) Impédance électrique.

xCELLigence RTCA DP est un courant alternatif 5 sinusoïdal. Dès lors, l'impédance électrique mesure l'opposition du système au passage de ce courant.

4 Le support est composé d'une surface en verre ou PET (poly(téréphtalate d'éthylène)) sur lequel sont déposées

les électrodes en or.

5 Le courant alternatif est un type de courant électrique dans lequel les électrons circulent de manière

alternative dans les deux sens du circuit. Le déplacement des électrons se limite à quelques millièmes de

millimètre. Si les électrons circulent lentement, l'énergie, elle, se déplace très rapidement et se transmet

instantanément au reste du circuit.

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L'impédance est une généralisation de la loi d'Ohm pour les circuits électriques en courant alternatif. apparente, notée Z, se mesure en ohm et est définie c (ampère) : impédance est un paramètre complexe qui fait intervenir, dans notre cas, différentes caractéristiques physiques du milieu et des cellules ainsi que la fréquence6 du courant auquel est soumis le système. De manière simplifiée, le système peut être modélisé par un circuit électrique (Figure 2). Figure 2. Modélisation simplifiée du système xCELLigence au niveau de l'interface électrode/cellule. (a) En absence de cellules, l'impédance a principalement deux composantes : l'impédance à l'interface électrodes/milieu (Zélec) et la résistance du milieu extracellulaire (Rmilieu). (b) En présence de cellules, l'impédance présente les mêmes composantes que précédemment auxquelles se rajoutent l'impédance des cellules (Zcell) représentées majoritairement par la capacitance membranaire7 et la résistance membranaire. Rj correspond à la résistance au niveau des contacts intercellulaires. Flèche rouge : circulation majoritaire du courant à basse fréquence. Flèche bleu : circulation majoritaire du courant à haute fréquence.

6 La fréquence du courant alternatif, mesurée en hertz (Hz), correspond au nombre de changement de sens

7 De par sa structure, la bicouche lipidique, constituée de phospholipides non conducteurs, confère à la cellule

des propriétés capacitives qui peuvent être représentées par un condensateur (deux éléments conducteurs : les

deux faces de la membrane, séparés par un isolant : la bicouche lipidique). La notion de capacité (C), exprimée

en farads (F) traduit la faculté de la membrane à accumuler des charges électriques. (a)

Electrode Z

Rmilieu

(b)

Z Electrode

Rj

Rmilieu

Zcell

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Dans le système représenté dans la Figure 2b, la circulation du courant au sein du puits dépend de la fréquence utilisée. Ce paramètre est important car en fonction de la fréquence utilisée, l'impact de la monocouche cellulaire sur la valeur d'impédance sera différent. Pour des courants de fréquence faible (en dessous de 2-4 kHz), le courant se déplace préférentiellement autour et entre les cellules (Figure 2b et Figure 3). A ces basses fréquences, la membrane plasmique agit comme un isolant et le courant n'est pas en mesure de traverser la cellule. La mesure de la variation d'impédance dans cette gamme de fréquence donne principalement des informations sur les modifications intervenant au niveau des contacts intercellulaires et des contacts entre les cellules et le support (adhésion)8. Pour des courants de hautes fréquences (supérieurs à 10 kHz), le courant se déplace principalement au travers des cellules (Figure 2b et Figure 3). Dans cette gamme de fréquence, la valeur d'impédance est principalement affectée par l'état des cellules incluant le nombre de cellules, la morphologie cellulaire et l'adhésion des cellules aux électrodes (Figure 4). Lappareil xCELLigence RTCA DP est paramétré pour délivrer un courant alternatif .

8 L'appareillage ECIS® développé par la société Applied BioPhysics permet de réaliser ce type d'analyse en

ajustant la fréquence appliquée au système : http://www.biophysics.com/index.php

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(a) (b) Figure 3. Illustration du déplacement du courant en fonction de la fréquence utilisée au niveau de l'interface électrode/cellule. (a) A de faibles fréquences, le courant se déplace principalement autour et entre les cellules (flèches rouges). A de hautes fréquences le courant se déplace principalement au travers des cellules (flèches bleues). A des fréquences intermédiaires le courant peut utiliser les deux voies en fonction de la fréquence (flèches noires). (b) Diagramme de Bode représentant l'influence de la fréquence du courant sur l'impédance en présence ou non de cellules. Dans ce système, l'impédance des courants extracellulaires domine entre 1 10 kHz (section I) alors qu'à partir de 10 kHz ce sont les courants transmembranaires qui influencent la mesure (section II)9.

9 Sources : thèse de Judith Anthea Stolwijk & article de Stolwijk JA et al., Pflugers Arch. 2015.

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Figure 4. Illustration de la variation d'impédance en fonction de la densité cellulaire. Plus la surface des électrodes recouverte par les cellules est importante, plus la valeur de l (source : ACEA Biosciences). En pratique, le système xCELLigence ne donne pas directement des valeurs Cell Index (noté CI). Le Cell Index est donné par la formule suivante: où Zcell (ft) est l'impédance mesurée à différents temps en présence de cellules, Z0

est l'impédance mesurée en présence de milieu de culture et en absence de cellule.

Z0 correspond donc à sur

mesurée au sein du puits.

En absence de cellules, Zcell = Z0 et CI = 0.

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A B C D 500 m

3) Applications.

Selon les processus cellulaires étudiés avec xCELLigence RTCA DP, nous utiliserons des types de microplaques différentes : a) Prolifération, signalisation et toxicité. Les E-plate et E-plate view (Figure 5) sont des microplaques utilisées pour de la prolifération, la signalisation et la toxicité cellulaire. Figure 5. E-plate et E-plate view. (A) -plate ou E-plate view. (B) Schéma simplifié du rélectrodes puits -plate view. La région centrale du puits faciliter es cellules par microscopie. (C) Photographie -plate -plate view. (D) Image en microscopie optique (x10) de cellules recouvrant un puits. Les lignes de ronds noirs correspondent aux électrodes (source :

ACEA Biosciences).

Quelle que soit le processus biologique étudié, il est conseillé dans un premier temps de réaliser une titration de la densité cellulaire afin de déterminer la dynamique de la réponse du Cell Index en fonction du type cellulaire étudié (Figure 6).

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05101520

0 2 4 6

Temps (heures)

Cell index

10,000 HEK293 cells

15,000 HEK293 cells

30,000 HEK293 cells

50,000 HEK293 cells

Figure 6. Prolifération de cellules HEK293. Mesure de la prolifération de cellules HEK293 pour différentes densités de cellules (5x104, 3x104, 1,5x104, 104 cellules). Il est important de noter que la valeur du CI mesurée dépend de la lignée cellulaire utilisée. Ainsi, comme représenté dans la Figure 7, à confluence, les cellules MCF7, COS7, HT29 et PC3 ne donnent pas le même CI. En effet, la valeur du CI dépend de la taille des cellules mais aussi de la nature des contacts que vont établir les cellules avec le support.

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Figure 7. Evolution du Cell Index pour différentes lignées cellulaires. A confluence (au plateau), les valeurs du CI sont différentes en fonction des lignées (CIMCF7 = 13; CICOS7 = 10; CIHT29 = 4; CIPC3 = 3). Source : ACEA Biosciences. Exemple 1 : étude de la toxicité cellulaire du 5-Fluorouracile (5-FU). Le système xCELLigence permet, par exemple, de mesurer en temps réel l'effet toxique sur la prolifération cellulaire. 5-FU10 sur des HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) en prolifération est mesuré en suivant l'évolution du CI au cours du temps (Figure 8).

10 Le 5-

cycle cellulaire.

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0204060

0 2 4 6 8

Temps (heures)

Cell Index

Base 25 M
50 M
100 M
[5-FU] 5-FU Figure 8. Prolifération de cellules HEK293 exposées au 5-FU. L'ajout à t = 24h de

5-FU dans des puits contenant des HEK293 ralenti ou bloque la prolifération

cellulaire selon la concentration utilisée. Exemple 2 : étude de la signalisation cellulaire. De la même manière, le système xCELLigence permet de réaliser population de cellules une mesure " globale » de la signalisation cellulaire induite par une molécule donnée. Ce type de réponse est illustré dans la Figure 9 par l'ajout de forskoline11 à des concentrations croissantes sur des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary). Dans ces expériences, la variation du CI reflète les modifications morphologiques des cellules (changement de forme et d'adhésion) en réponse à une stimulation induite par la forskoline. Dutilisant des inhibiteurs des voies de signalisation ont permis par exemple de décomposer les différentes phases de la réponse cellulaire suite à la stimulation par différents ligands du récepteur ȕ2-adrenergique12. Il est important de rappeler ici l'intérêt de ce type de système qui permet de travailler sur des cellules

11 La forskoline est un activateur de l'adénylate cyclase qui va induire une production d'AMPc par la cellule

stimulée.

12 Stallaert et al., Impedance responses reveal b2-Adrenergic receptor signaling pluridimensionality and allow

classification of ligands with distinct signaling profiles. PLOSOne 2012.

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010203040

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Temps (heures)

Cell Index

Base 0.1nM 1nM 10nM 100nM
M M M [Forskoline]

Changement

milieu Fsk -10-8-6-4 0.0 0.5 1.0 1.5 log[Fsk] (M)

Normalized Cell Index

EC508.573e-006

10,000 CHO-G4 cells / well

primaires exprimant un récepteur d'intérêt à des niveaux physiologiques et sans aucune modification des cellules. Pour des analyses systématiques, il sera plus

facile de travailler sur des lignées exprimant de manière stable une protéine d'intérêt.

(A) (B) Figure 9. Profil de réponse de cellules CHO à l'ajout de forskoline. (A) Réponse des cellules CHO à l'ajout de forskoline après un changement de milieu à t = 24h. (B) Dose-réponse de la forskoline mesurée au pic de réponse (EC50 = 8 M).

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b) Migration cellulaire. Le suivi en temps réel et en continu de la migration cellulaire peut être réalisé en utilisant des microplaques particulières : les CIM-plate (Figure 10).

Figure 10. CIM-plate. (A) Photographie -plate.

CIM-plate avec les chambres séparées par une membrane perforée de pores de

8 m de diamètre permettant aux cellules de passer de la chambre supérieure vers

la chambre inférieure. Les électrodes tapissent la face inférieure de la membrane. Ce système " mime » la chambre de Boyden classiquement utilisée pour étudier la migration cellulaire. L'avantage du système xCELLigence par rapport à la chambre de Boyden migration cellulaire en temps réel. Ainsi, l " chimio-attractant » est présent dans la chambre inférieure, les cellules de la chambre supérieure qui sont sensibles au chimio-attractant vont migrer de la chambre supérieure vers la chambre inférieure en traversant les micropores de la membrane (diamètre des pores : 8 m). Ces cellules vont ensuite adhérer au support sur lequel repose les électrodes comme représenté dans la Figure 10. A B

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30 000 cellules

5% SVF-bas

15 000 cellules

5% SVF-bas

30 000 - 15 000 cellules

0% SVF-bas

Migration

Prolifération + (Migration)

L'augmentation de la valeur du CI reflète dans ces expériences la présence des cellules dans la chambre inférieure (Figure 11). Figure 11. Analyse en temps réel de la migration de cellules HOS (Human bone OsteoSarcoma). Courbes de migration obtenues avec deux densités de cellules HOS en absence ou en présence du sérum de veau comme chimio- attractant. En absence de sérum dans la chambre inférieure (0% SVF bas), les cellules ne migrent pas.

4) Appareillage.

LxCELLigence RTCA DP est composé de 3 supports (Figure 12) pouvant fonctionner indépendamment ou de manière groupée (par 2 ou par 3). Il est ainsi possible d'analyser simultanément entre 16 puits et 48 puits (n = 3 supports).

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Figure 12. Station de mesure RTCA DP avec 3 supports de plaques 16 puits.

Conclusion

Le système xCELLigence permettant de

travailler aussi bien sur des lignées stables que sur des cellules primaires sans nécessité de modifier les protéines d'intérêt et/ou les cellules.quotesdbs_dbs50.pdfusesText_50

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