[PDF] Manuel des Travaux Pratiques de Bactériologie

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2019-2020

Dr. BOUSSENA SABRINA

Institut des Sciences Vétérinaires

Département de Productions Animales

2019-2020

Manuel des Travaux Pratiques

de Bactériologie

Table des matières

AVANT- 1

TP. N° 1 : 2

2 3

1.1.1 Niveau de 3

3 4 4 : les différents locaux d 5 6 6 8 9

7. Présentation et organisation des postes de manipulation stérile et de

9 9

7.1 Organisation de poste de 10

11 12 13

9.2 Types de milieux de 13

13 14 14 14

10. La 15

15 15 16 TP. N° 2 : LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE : I. Premières étapes du diagnostic bactériologique (étude des caractères 17 17 19

2.1. Etat 19

19 20 20 20

2.2.2 20

20 21
21
TP. N° 3: LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE (suite)°: 22
22
23
24

2.2 Test 24

25
28
28
28
29
31
31

3.1.3.2. Test VP (Vosges- 31

32

3.1.5 Mannitol- 33

34
35
36
38

TP. N° 4: 41

41
42
42
42
43
44

3.1 Préparation de 45

46
47
48
48

3.4.2 48

49
50

4. E- 54

55
56
Manuel des Travaux Pratiques ___________________________________________ Dr. BOUSSENA 1

AVANT-PROPOS

Le présent manuel constitue un recueil des travaux pratiques de bactériologie destiné non seulement aux étudiants préparant leur diplôme de docteur vétérinaire

Institut des Sciences Vétérinaires

leurs compétences et ont accès à des outils appropriés pour les guider lors des

travaux pratiques, nous avons soigneusement mis en place ce document avec Concernant la formation des étudiants vétérinaire, ce manuel vise aussi à apporter, les connaissances sur un ensemble de pratiques réalisées dans le laboratoire afin

Ainsi, quatre séries de travaux pratiques ont été établies avec toute la rigueur

pédagogique) et les disponibilités (milieux de cultures et réactifs) du laboratoire de

Institut des Sciences Vétérinaires.

Un premier TP intitulé "Laboratoire de bactériologie " traite les consignes de sécurité, exercées au niveau du laboratoire de bactériologie médicale. Il est à noter que les

différentes parties abordées dans cette section ont été présentées tout en accordant

une importance particulière à la protection du manipulateur sans compromettre la qualité des résultats. Un deuxième et un troisième TP réunirent les renseignements

relatifs aux étapes du diagnostic bactériologique et les critères à étudier afin

isoler au sein du labo ce test dans la pratique vétérinaire. présent document ne sont pas exhaustifs suggestion sus Manuel des Travaux Pratiques ___________________________________________ Dr. BOUSSENA 2 TP. N° 1. LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE : Structure, organisation et manipulation Objectifs : familiariser les étudiants avec un laboratoire de bactériologie médicale, son équipement et son fonctionnement. - ctériennes responsables de cette infection. - -à-dire

1. Types de laboratoires de bactériologie

Les laboratoires de bactériologie (ou encore de microbiologie ou de biologie) sont non. Les manipulations sont réalisées dans des laboratoires dits de confinement (1-

4) pour les substances pathogènes (cf. niveaux de confinement).

bactéries pathogènes à travers : - lxamen microscopique : lecture au microscope optique de lames (mise au point) colorations (Bleu de méthylène, Gram). - solement sur milieux de culture bactérienne. - la reconnaissance de (caractères culturaux). - la reconnaissance d. antibiotiques (antibiogramme) sont couramment réalisées au sein du laboratoire de bactériologie médicale. pollution et même dans des conditions particulières, la mise en évidence de bactéries potentiellement pathogène sont les principaux objectifs recherchés. 3

Le contrôle de qualité (contrôle de stérilité, contrôle de qualité de substances

inhibant (antibiotiques par ex.) ou favorisant la croissance bactérienne fait également partie des missions des laboratoires de bactériologie.

1.1 Niveaux de confinement

Selon le risque issu des bactéries isolées, il existe 4 niveaux de sécurité biologiques (confinement) :

1.1.1 Niveau de confinement 1

Ce niveau de confinement concerne le laboratoire de base pour la manipulation des agents du groupe de risque 1 (aucune conception spéciale, enceintes de sécurité biologique (hotte à flux laminaire). personne saine ou un animal sain. Ils présentent un risque faible et la collectivité.

1.1.2 Niveau de confinement 2

Ce niveau de confinement est adapté à la manipulation des agents du groupe de liés à des organismes devant être manipulés en niveau de confinement 2 osition de membranes muqueuses. Les agents pathogènes traités dans un niveau de confinement 2 ne sont (manipulation dans des enceintes de sécurité biologique, port des équipements de protection personnels appropriés tels que les gants, les lunettes, etc). Agents du groupe de risque 2 : Agents pathogènes susceptibles de provoquer une maladie , un danger grave pour le personnel du laboratoire, pour la collectivité, pour le bétail ou pour rovoque exceptionnellement des infections graves. Néanmoins, il existe des mesures préventives et thérapeutiques efficaces, et le risque de est limité. Les risques sont considérés comme modérés pour les utilisateurs mais faible pour la collectivité. 4

1.1.3 Niveau de confinement 3

Ce niveau de confinement permet la manipulation des agents du groupe de risque 3. Les agents pathogènes étudiés en niveau de confinement 3 sont transmissibles par voie aérienne même à faible dose infectieuse, qui est susceptible de provoquer des maladies graves, voire mortelles. Des barrières primaires et secondaires additionnelles sont nécessaires pour limiter dans le Il est par conséquence exigé une protection respiratoire appropriée, des filtres spéciaux pour t un accès strictement contrôlé au laboratoire pour la prévention de la transmission de tels organismes. Agents du groupe de risque 3 : Agents pathogènes responsables généralement une maladie humaine grave ou présentant de lourdes conséquences économiques, mais qui se transmet exceptionnellement par simple contact de personne à personne et qui cause rarement des maladies ne pouvant pas être traitées par des agents antimicrobiens ou antiparasitaires. Les risques sont importants pour les manipulateurs mais faibles pour la collectivité.

1.1.4 Niveau de confinement 4

Cest le niveau de confinement extrême. Il

transmissibles par aérosol avec une faible dose infectieuse et entraînant des graves maladies souvent mortelles, pour lesquelles en général traitement ou de pathogène) décontaminés. Agents du groupe de risque 4 : agents pathogènes entraînant généralement de très grave maladie humaine, souvent impossible à traiter, facilement transmissible par simple contact par les voies direct ou indirect animal à une personne et vice-versa. Les risques sont élevés pour les manipulateurs et pour la collectivité. 5

2. Laboratoire de bactériologie médicale : les différents locaux de

travail et les postes de manipulation

Le laboratoire de bactériologie d

(ISVK) est en charge des travaux pratiques en bactériologie médicale et des cliniques des maladies infecti des . rtés

par les étudiants vétérinaires, les vétérinaires praticiens, les éleveurs et les

propriétaires des animaux de compagnies. Ces prélèvements utilisés comme produits pathologiques servent comme outils pédagogique pour la formation des étudiants lors des travaux pratiques et des cliniques. laboratoires (zone de tri). Les échantillons ainsi acceptés sont alors identifiés par des codes enregistrés qui les suivront tout au long de leur parcours dans le laboratoire. En fonction des examens demandés, les échantillons peuvent être analysés par Les résultats de ces analyses sont ensuite enregistrés manuellement dans un registre de laboratoire ou informatiquement. Les étudiants sous la supervision des enseignants participent aux différentes taches de manipulations effectuées lors du diagnostic bactériologiques (microscopie, culture, identification biochimique, et tests de sensibilité aux antibiotiques). tut des Sciences Vétérinaires Khroub dispose aussi de 4 principales pièces techniques (compartiments) distinctes et suffisamment séparées, réservées exclusivement aux analyses de bactériologie ;

- la première pièce est réservée aux manipulations stériles, les colorations, les

pathologiques, - le second compartiment (deuxième pièce) est réservé à la préparation des milieux - le t déchets des manipulations. 6

dédiée aux manipulations stériles a été conçue afin de permettre à plusieurs

personnes de manipuler au même temps. Le laboratoire est munit de deux accès afin de limiter le croisement des flux.

3. Règles à suivre durant les travaux pratiques

Quels que soient le but recherché et en conséquence, les méthodes à appliquer dans le laboratoire de bactériologie (médicale et alimentaire), le bactériologiste doit impérativement respecter certaines règles essentielles : - roduit pathologique manipulé : cette règle importante doit toujours être respectée quelles que soient les bactéries en question. - éviter de contaminer le produit pathologique manipulé : La contamination d'un poste de travail et par conséquence du produit pathologique risque de compromettre le résultat du diagnostic. Pour répondre à ces règles impérieuses, le bactériologiste doit s'astreindre au respect de gestes précis de travail que certains auteurs ont qualifiés de "gestes rituels de la bactériologie » et d'autres, de réflexes conditionnés.

4. Les consignes de sécurité

- Porter une blouse blanche fermée et manches longue. - Interdiction formelle de boire, manger, de fumer, de mâcher du chewing- pendant les TP ou de sortir de la salle de TP sans motif valable. - Cet les ongles courts. - Ne pas manipuler les téléphones portables pendant les TP. - Ne porter aucun bijou aux poignets et surtout aux doigts. - Eviter le contact des réactifs de Gram avec la peau. - Procéder à un lavage minutieux des mains, avec brossage des ongles avant et après les manipulations, et avant toute sortie même momentanée de la salle de TP. - Éviter les ouvertures des fenêtres, de portes pendant les manipulations. 7 assis(e), sans geste brusque. - Ouvrir avec réglé en intensité moyenne (flamme bleu) (cf. Fig. 1)] les récipients contenant des cultures microbiennes, afin d'éviter toute projection. - Les tubes ou les flacons ne sont jamais tenus verticalement mais obliquement, leur ouverture dirigée vers la flamme. Les pipettes, pipettes Pasteur ou pipettes graduées doivent être maintenues en position oblique, leurs pointes dirigées vers le bas. - et pour un manipulateur droitier, la main droite, qui ou la pipette Pasteur, ne doit pas se déplacer (coude de la main droite sur la paillasse). Tout le matériel nécessaire : tubes de milieux de cultures, tubes de liquide de dilutions, tubes stériles ou lames, doit être porté par la main gauche vers la main droite (cf. Fig. 2). prélèvements, en commençant par chauffer la partie moyenne de l'instrument afin de dessécher les restes de culture avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci pour éviter toute projection. - Prévenir immédiatement le responsable de TP en cas de bris d'un récipient contenant une culture, en cas de contamination accidentelle d'un manipulateur ou tout incident dispersant le matériel microbien. - Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation. - Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise à l'abri des souches microbiennes ainsi que leur destruction afin d'éviter toute contamination. - Vet de gaz. 8

Fig. 1 : Rôles du bec bunsen.

Fig. 2 : La m

bactérienne.

5. Consignes de propreté

Nettoyer les éviers des colorants et remplir les pissettes eau et alcool. Ramener tout le matériel sur les paillasses et ranger le matériel utilisé. -amylique et couvrir les microscopes et la loupe.

Flamme bleu

9 réfrigérateur.

Lavage minutieux des mains.

oit de travail et du matériel Toutes les manipulations sont réalisées sur la paillasse. Elle doit mesurer au minimum 60 cm (90 cm) de largeur sur 1,5 m de longueur. Elle doit être recouverte d'un matériau de préférence de couleur blanche, lisse, incombustible, résistant aux antiseptiques, aux acides, aux bases et aux colorants (marbre par ex.). Toute la salle

doit être bien éclairée (les reflets gênants et les lumières éblouissantes sont à éviter)

de façon à éviter les ombres portées sur la paillasse. Les revêtements de sol doivent

êtres antidérapants.

de la verrerie, le laboratoire est équipé du matériel suivant : - petit matériel : bec bunsen, anse de platine, pipettes Pasteur, micropipettes, pinces, lames, ...). - : microscopes et loupes binoculaires. - conservation : incubateurs (étuves), réfrigérateur et congélateur. - matériel de stérilisation et de décontamination : hotte à flux laminaire, autoclaves, stérilisateurs et centrifugeuses. - ication, de transport et de conservation) : agitateurs, balance à précision, bains Marie, distillateur.

7. Présentation et organisation des postes de manipulation stérile et de

coloration

7.1 Organisation de poste de manipulation stérile

Le poste de manipulation stérile est organisé de la façon suivante : Le bec bunsen les conditions de stérilité locale indispensables à la manipulation stérile, est placé au centre du poste de travail de 15

à 30cm du bord de la paillasse de sorte à

10 manipulation. A droite du bec bunsen se trouvent les instruments nécessaires au travail pour un manipulateur droitier (pipettes Pasteur entreposées dans un récipient à large ouverture, anse de platine et les pinces disposés sur un portoir). Le reste du matériel est placé à gauche du bec bunsen (le produit pathologique à étudier, les boites de Petri placées couvercle en bas bec bunsen et légèrement à droite, solution antiseptique (eau de javel par exemple) dans lequel seront déposées les pipettes Pasteur Fig. 3 : Organisation du poste de manipulation stérile. Le travail est réalisé en position assise ce qui nécessite que tout le matériel soit disposé à portée de main. commencer la manipulation (tout le matériel doit être accessible sans que l ait à se déplacer ou à être aider par ces collègues). II doit pouvoir manipuler sans que rien ne s'interpose entre lui et la flamme.

7.2 Organisation de poste de coloration

Quant au poste de coloration, il doit comprendre un bac à coloration surmonté -lame (surmonté lui- de ce bac, une batterie de colorants, de mordant, des pissettes et lames à colorer. 11

8. Ensemencement et mise en culture des bactéries

est le transport des bactéries dans un milieu de culture neuf et doit obligatoirement faites en milieux liquides (enrichissement) ou en milieux solides (isolement). diagnostic bactériologique, la mise en culture est toujours nécessaire. Si le prélèvement plusieurs espèces bactériennesisoler les bactéries caractères biochimiques ces bactéries. nsemencement peut se faire en stries

transversales sur les milieux solidifiés inclinés (stries parallèles et serrées sur la

des milieux en culot (ensemencement en piqûre par le fil en platine ou par une pipette Pasteur à bout fermé). Sur milieux de culture solides coulés en boites de Petri, plusieurs techniques : (cf. Fig. 4 et 5)

Fig. 4

1.

2. Ensemencer par stries fines et très serrées le premier demi-cercle.

3.

4. Ensemencer le deuxième demi-cercle.

5.

6. Ensemencer le troisième demi-cercle.

12 Fig. 5 : Ensemencement selon la technique des 4 séries de stries.

1. Tracer sur le fond extérieur de la boite de petri deux diamètres

perpendiculaires séparant la boite en quatre secteurs.

2. Prélever à l'anse (stérile) la suspension ou le bouillon dans le cône

stérile.

3. Avec la main gauche saisir la boite (couvercle sur la paillasse) dans le

prélèvement par stries très serrées dans une moitié de quadrant (quadrants 1et

2), flamber l'anse et laisser refroidir.

4. Etaler à nouveau le prélèvement par stries moins serrées dans la moitié

correspondante aux quadrants 2 et 3, flamber l'anse et laisser refroidir.

5. Répéter une dernière fois l'étalement en stries encore moins serrées dans

la moitié correspondante aux quadrants 3 et 4.

La vérification de la température des incubateurs doit être un geste journalier et

habituel au bactériologiste.

9. Préparation et utilisation des milieux de culture

- Les micro-organismes exigent pour leur croissance des aliments. Ces aliments leur sont fournis au laboratoire par des milieux nutritifs ou milieux de culture. Comme les besoins nutritionnels des microorganismes et les conditions de leurs développements sont très variés, il n'existe évidemment aucun milieu universel sur lequel tous les microbes soient capables de se multiplier. 13 - Toutefois, certains milieux conviennent au développement d'une grande variété de germes microbiens; le choix de tels milieux repose sur la connaissance de l'habitat naturel et de la physiologie alimentaire du groupe de germes que l'on désire cultiver. - D'une manière très générale, on peut distinguer : Les milieux sont soit liquides, soit solides. Les milieux solides présentent un grand intérêt et permettent, lorsque la technique d'ensemencement est convenable, le développement des germes en colonies apparentes, isolées les unes des autres, provenant en principe, de la multiplication d'une seule bactérie (clone) et à partir desquelles peuvent être obtenues des cultures pures.

9.1 Préparation des milieux en poudre

Matériels : distillateur, béchers, éprouvette graduée, thermomètre, agitateur magnétique, balance à précision, autoclave, bec bunsen, boites de Petri, des tubes à vis ou cotonnés stériles, pince en bois ou gants.

Mode opératoire :

- Peser la masse nécessaire de poudre pour un volume (ml) d'eau distillée. - Dissoudre la poudre dans le diluant à l'aide de l'agitateur magnétique et chauffer jusqu'à l'ébullition. - Laisser refroidir la préparation dans le cône stérile du bec bunsen. - Lorsque la préparation a atteint une température inférieure à 60°C, verser dans des flacons - Lorsque la préparation a atteint de nouveau une température inférieure à 60°C, coulé dans des boites de Petri ou des tubes à vis stériles. - eau de condensation dans les boîtes de Petri perturbe la surface du milieu gélosé, on place les boîtes en position retournée.

9.2 Types de milieux de culture

9.2.1 Milieu sélectif

Un milieu de culture est dit sélectif pour une espèce microbienne lorsque seules les exigences nutritives et les conditions de développement spécifiques de cette espèce autres voient leur développement entravée voir inhibée. 14 -chimiques (tels que certaines substances telles que : sels minéraux (azide de sodium, tellurite de sodium, Ils sont utilisés pour isoler les germes de produits poly-microbiens. La nature des inhibiteurs est variable, il peut s'agir : - Staphylococcus, bouillon hypersalé à

Enterococcus.

- de sels biliaires (désoxycholate) : Mac Conkey, Hektoen pour Enterobacteriaceae. - d'antibiotiques: gélose au sang + ANC (acide nalidixique, colistine) pour les

Streptococcus.

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