[PDF] RAPPORT DE STAGE DE BACTERIOLOGIE ET DE PARASITOLOGIE

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RAPPORT DE STAGE DE BACTERIOLOGIE ET

DE PARASITOLOGIE

Effectué au Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie

E.S.S.Agro.

Du 03 Août 2014 au 31 Octobre 2014

Présenté par : RAZAFINDRABE Tsiriniaina Jean Luco

Doctorant à l'A2E E.S.S.Agro.

i

REMERCIEMENTS

Nous tenons à remercier :

- Le Programme des Nations Unies pour le Developpement (PNUD), l'Organisme des Nations Unies pour l'Education, la Science et la Culture (UNESCO) et du Comité

Scientifique (CS) ;

- L'Université d'Antananarivo à travers toute l'équipe G/DHD dirigée par Monsieur le Vice Président de la Formation et de la Recherche ; - Tout le personnel du Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSAgro. Nous adressons, particulièrement, nos vifs remerciements et toutes nos chaleureuses gratitudes à Monsieur le Professeur RAKOTOZANDRINDRAINY Raphaël, Chef de Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSAgro. et aussi notre encadreur. C'est avec un grand plaisir que nous réservons ces lignes en signe de gratitude et de

reconnaissance à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin pour la réalisation de ce stage.

SOMMAIRE

REMERCIEMENTS ................................................................................................................... i

INTRODUCTION

...................................................................................................................... 1

CONTEXTE ................................................................................................................................ 1

HISTORIQUE ET ACTIVITES DU SITE D"ACCUEIL ....................................................... 2

METHODOLOGIE .................................................................................................................... 3

I. COLLECTE DE FECES DE BOVIN .............................................................................................. 3

I.1. Nature et condition de prélèvement ..................................................................................... 3

I.2. Lieu et modalité de prélèvement .......................................................................................... 3

I.3. Etiquetage............................................................................................................................... 3

I.4. Acheminement et transport .................................................................................................. 3

I.5. Réception au laboratoire ....................................................................................................... 3

II. EXAMEN BACTERIOLOGIQUE DES SELLES (COPROCULTURE)............................ 3

II.1. Examen macroscopique des prelevements ...................................................................... 3

II.2. Culture : ensemencement et isolement ............................................................................ 4

II.2.1. Milieu de culture ............................................................................................................ 4

II.2.2. Technique de culture et isolement ................................................................................ 5

II.3. Identification ...................................................................................................................... 5

II.3.1. Aspect des colonies ........................................................................................................ 5

II.3.2. Examen microscopique direct ...................................................................................... 5

II.3.3. Tests metaboliques (glucidiques, protéiques, lipidiques) ........................................... 7

II.3.4. Autres tests d"identification .......................................................................................... 7

II.4. Antibiogramme .................................................................................................................. 8

II.4.1. Technique et réalisation sur gélose Mueller Hinton ................................................... 8

II.4.2. Lecture et interprétation ............................................................................................... 8

III. EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES .................................................................. 9

III.1. Technique de sédimentation ............................................................................................. 9

III.2. Différents types d"œuf d"helminthes des bovins observés .............................................. 9

Pages

RESULTATS ............................................................................................................................ 10

CONCLUSION ET PERSPECTIVES .................................................................................... 11

ANNEXES ................................................................................................................................. 12

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................... 15

1

INTRODUCTION

Dans le cadre de la préparation du doctorat en santé animale au sein de l'Ecole doctorale A2E ESSAgro de l'Université d'Antananarivo, le Programme des Nations Unies pour le Developpement (PNUD), l'Organisme des Ntions Unies pour l'Education, la Science et la Culture (UNESCO) en coopération avec l' Université d'Antananarivo à travers la Gouvernance et Développement Humain Durable (G/DHD) nous a offert un stage académique 3 mois au sein du Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSA-Université d'Antananarivo Notre thème concerne " la diarrhéé bovine : causes microbienne et parasitaire dans les régions d'Amoron'i Mania et Vakinankaratra ». C'est pourquoi l'objectif de notre

stage focalisé sur le savoir-faire des analyses bactériologiques et parasitologiques relatifs à la

connaissance des causes de la diarrhée bovine.

CONTEXTE

A Madagascar,

l'elevage bovin occupe une place très importante dans le cadre du développement en intervenant dans plusieurs domaines économiques, sociologiques et culturels (1). Comme toute spéculation, il rencontre des problèmes de maladies telles que la diarrhée banale, le météorisme, les helminthoses (2). La diarrhée entraine des pertes économiques pour les éleveurs alors que sa cause exacte reste encore méconnue. 2

HISTORIQUE ET ACTIVITES DU SITE

D'ACCUEIL

Le Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSA-Université

d'Antananarivo a été fondé en 1990 grâce au sutien financier de la Suisse sous la direction du

Docteur TYBERAENC (vétérinaire). En 1996, la coopération française a contribué pour l'appui technique et financier. En 2007, l'Union Européenne a assuré la réhabilitation du laboratoire. Le Professeur RAKOTOZA NDRINDRAINY Raphaël a dirigé le laboratoire depuis mai 1993 Les activités de ce laboratoire se focalisent sur les examens parasitologiques et

bactériologiques pour les stages et les travaux pratiques des étudiants ainsi que les travaux de

recherches pour les mémoires de fin d'étude et les thèses de doctorat. Le personnel est composé du Chef de Laboratoire, de 2 Docteurs vétérinaires Doctorants et de 2 Techniciens de laboratoire et d'un Assistant Administratif. 3

METHODOLOGIE

I. COLLECTE DE FECES DE BOVIN

I.1.

Nature et condition de prélèvement

Les prélèvements sont des matières fécales fraichement émises provenant des bovins présentant de signes de diarrhée. I.2.

Lieu et modalité de prélèvement

Les prélèvements ont été pris dans les tueries d'Ampasika et chez quelques éleveurs situés dans les Fokontany Andraisoro et Ambatomaro. Pour le receuil du prélèvement, la fouille rectale a été pratiquée. I.3.

Etiquetage

Bien emballé dans un sachet, ces matières fécales sont étiquetées pour éviter toute

confusion. I.4.

Acheminement et transport

Les prélèvements ont été transportés jusqu'au laboratoire d'analyse de l'ESSAgro. dans une glacière munie d'accumulateurs de froid pour bloquer la multiplication bactérienne et l'évolution des oeufs de parasites (Annexe 1). I.5.

Réception au laboratoire

Arrivés au laboratoire, ces prélèvements sont mis dans un réfrigérateur (conservation maximale 8 heures à 4°C) jusqu'au moment du début de l'analyse. II. EXAMEN BACTERIOLOGIQUE DES SELLES (COPROCULTURE) L'examen bactériologique des selles se fait par coproculture, en ensemençant ces

dernières sur des milieux de culture appropriés. Le but est de rechercher des bactéries réputées

pathogènes. II.1.

Examen macroscopique des prelevements

Chaque prélèvement est observé pour noter son aspect et sa consistance : la présence de mucus, sa couleur noirâtres, son odeur (nauséabonde). 4 II.2.

Culture : ensemencement et isolement

II.2.1.

Milieu de culture

II.2.1.1.

Types Plusieurs types de milieu de culture sont utilisés : o Gélose au sang et gélose au chocolat : gélose ordinaire favorable à la croissance et multiplication bactérienne et même ceux qui ont besoin d'un facteur de croissance. o

Bouillon selenite

o

Gélose Salmonella-Shigella

o Gélose Mac Conkey : c'est un milieu sélectif pour les bacilles Gram négatifs o Gélose Mueller-Hinton : milieu adapté pour l'antibiogramme o Autres milieux : bouillon au sélénite, Salmonella Shigella agar.

II.2.1.2.

Procédure de préparation

Pour la gélose au sang et la gélose au chocolat, on a utilisé le " Columbia blood agar base CM0331 » qui se présente sous forme de poudre à dissoudre à raison de 39g/l d'eau

distillée et stériliser pendant 15mn à 121°C à l'autoclave. Ce milieu est refroidit jusqu'à 50°C

à la bain-mari pour la gélose au sang (70°C pour la gélose au chocolat) puis ajouter 5% de

sang de mouton et repartition dans des boîtes de Pétri (20ml par boîte) et conserver dans un

refrigerateur après solidification.

Pour la gélose Mac

Conkey (Mac Conkey agar CM0115),

51,5 gsont dissous dans un

litre d'eau distillée et porter à ébullition jusqu'à ébullition complète. Stériliser 15mn à 121°C

à l'autoclave, laisser refroidir puis repartir dans des boîtes de Pétri (20ml par boîte) puis

conserver dans un réfrigérateur après solidification. La même opération est respectée pour la gélose Mueller-Hinton (Mueller-Hinton agar CM0337 ) avec dissolution de 38gdans un litre d'eau distillée (Annexe 2). Pour Sélénite broth base CM0395, la préparation se fait comme suit : dissoudre 4g de

biselenite de sodium dans 1l d'eau distillée et ajouter 19g de milieu de base, chauffer jusqu'à

dissolution complète puis bien melanger et repartir en tubes sur une hauteur de 5cm, steriliser au bain-marie bouillant pendant 10mn, ne pas autoclaver. 5 Pou r S.S.Agar CM0099 : dissoudre 63g de poudre dans un litre d'eau distillée puis p orter à l'ébullition en agitant fréquemment et maintenir un leger frénissement jusqu'à dissolution complète puis refroidir jusqu'à 50°C, mélanger et répartir.

II.2.2.

Technique de culture et isolement

La culture permet d'obtenir des colonies bactériennes. Elle se fait en strie à l'aide

d'une anse en platine sur le milieu de culture et renverser la boîte (milieu en haut) et incuber à

37°C pendant 1

8

à 24 heures.

L'isolement est une technique qui permet de séparer les différentes bactéries d'un échantillon. L'isolement permet d'observer les colonies.

Si les colonies sont isolées, on peut

procéder à l'identification. II.3.

Identification

II.3.1.

Aspect des colonies

Cet examen apprécie

La couleur de la colonie qui peut être jaune, blanche, blanchâtre, grise ou gris blanc. La forme de la colonie : arrondie ou irrégulière La taille de la colonie : petite , moyenne (1mm de diamètre) ou grande L'aspect de la colonie : lisse ou rugueuse (Annexe 3) Le pouvoir hémolytique : se voit sur gélose au sang avec différents types : o

ȕ-hémolytique

o

Į-hémolytique

II.3.2.

Examen microscopique direct

II.3.2.1.

Examen direct a l'état frais

a.

Matériels

Lame et lamelle

Microscope optique

6 b. Principe

Que ce soit

leprélèvement (calque d'organe, pus, plaie) ou prise d'un échantillon de la colonie dans le milieu ensemencé , il faut respecter les étapes suivantes :

Prendre une lame bien stérile

Y déposer quelques gouttes d'eau distillée

Prendre un échantillon de la colonie du milieu ensemencé par un oese et mélanger avec les gouttes d'eau. Recouvrir d'une lamelle et lecture au microscope avec objectif X 40. Résultat : cet examen direct permet d'observer : La forme de la bactérie (cocci, bacille, coccobacille)

La mobilité de la bactérie :

Mobile pour le cas d'un bacille à ciliature péritriche comme Salmonella et

Escherichia coli ;

Immobile pour les cocci comme les Staphylocoques et Streptocoques (mouvement brownien) (Annexe 4).

II.3.2.2.

Examen direct apres coloration de Gram

a.

Matériels et colorants

o

Lame bien propre

o Feu o

Anse de platine avec boucle

o

Violet de Gentiane

o Lugol o

Ethanol

o

Safranine

o

Microscope

b. Principe o

Utiliser une lame propre

o

Prélever les colonies

o

Etaler et fixer à la chaleur

o

Colorer au Violet de Gentiane pendant 1mn

7 o

Rejeter le colorant

o Verser le lugol pour fixer le colorant pendant 1 mn o Rejeter le lugol et verser l'alcool pour décolorer la préparation o

Rejeter l'alcool et rincer avec l'eau

o Verser l'encre de fuschine pendant 30 secondes et rejeter de nouveau o

Rincer avec l'eau et sécher la lame

o

Verser de l'huile de Cèdre

o

Lecture au microscope avec objectif X100

c. Résultats o Bactérie à Gram positif : préparation de couleur violet au microscope ; o Bactérie à Gram négatif : préparation de couleur rose (Annexe 5).

II.3.3.

Tests metaboliques (glucidiques, protéiques, lipidiques) Métabolisme glucidique : fermentation des sucres comme le glucose, le lactose, le saccharose. Métabolisme protéique : désamination, décarboxylation. Métabolisme lipidique : présence de différente lipase.quotesdbs_dbs27.pdfusesText_33

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