[PDF] LE CHAMPAGNE 2. DOSAGE DE L'ETHANOL

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LE CHAMPAGNE

Les levures utilisées dans l'élaboration du champagne sont en général des souches commerciales sélectionnées. Elles transforment le sucre en alcool et en dioxyde de carbone

lors de la première fermentation puis lors de la prise de mousse. Outre le suivi des fermentations, les techniciens de laboratoire réalisent de nombreux

contrôles, notamment des études de propreté mi crobiologique au niveau de la cuverie, des chaînes d'embouteillage...

Le personnel des caves est suivi régulièrement par la médecine du travail afin de dépister

d'éventuelles maladies professionnelles.

1. ANALYSE D'UNE PREPARATION COMMERCIALE DE LEVURE

A la suite d'un changement de

fournisseur, le laboratoire d'oenologie analyse une levure déshydratée nouvellement référencée.

Une suspension S de cette levure a été préparée en introduisant 0, de levure déshydratée

dans une fiole jaugée de 100 mL puis en ajoutant de l'eau physiologique jusqu'au trait de jauge. Après homogénéisation, plusieurs analyses sont effectuées sur cette suspension S.

1.1. Comptage hématimétrique

1.1.1. Manipulation

Réaliser un comptage hématimétrique de la suspension S en effectuant, si nécessaire, des

dilutions adaptées. Les caractéristiques de l'hématimètre utilisé (Malassez) figurent sur le document 1.

Matériel :

hématimètres tubes à vis pipettes stériles de 1 et 10 mL eau physiologique.

1.1.2. Résultats

Calculer le nombre de cellules de levures par mL de suspension S. En déduire le nombre de cellules de levures par g de levure déshydratée.

1.2. Dénombrement par culture sur milieu gélosé

A l'aide du résultat précédent :

mettre au point un protocole de dénombrement des levures de la suspension S par culture sur milieu gélosé, effectuer ce dénombrement.

Matériel :

6 boîtes de milieu OGA (oxytétracycline, glucose, agar)

étaleurs stériles

pipettes stériles de 1 mL diluant : tubes de 9 mL d'eau physiologique stérile 2

Données :

ensemencement par étalement en surface de 0,1 mL d'inoculum (suspension S ou dilutions)

2 essais par dilution

résultats interprétables : 15 à 150 colonies par boîte Remarque : après incubation à 37°C, la lecture sera effectuée par un examinateur.

2. DOSAGE DE L'ETHANOL DANS LE VIN TRANQUILLE

Dans la méthode champenoise, le vin tranquille est le produit obtenu après la première fermentation.

On se propose :

de doser l'éthanol sur un échantillon par méthode enzymatique en point final, de déterminer la concentration d'activité catalytique de l'alcool déshydrogénase utilisée dans cette méthode.

2.1. Distillation de l'alcool

L'alcool d'un vin tranquille a été distillé selon le protocole suivant : Introduire dans l'appareil à distiller préalablement rincé :

E = 20 mL de vin

10 mL de solution d'hydroxyde de sodium à 1 mol.L

-1

100 mL d'eau distillée

quelques grains de pierre ponce ou des billes de verre Recueillir le distillat dans une fiole jaugée à 200 mL contenant environ 60 mL d'eau distillée, maintenue dans la glace. Ajuster à 200 mL avec de l'eau distillée pour obtenir le distillat D. Le distillat D conservé à +4°C sera fourni sur demande.

2.2. Dosage enzymatique de l'éthanol par méthode UV

L'alcool est dosé par voie enzymatique ; l'absorbance du NADH formé au cours de la réaction catalysée par l'alcool déshydrogénase (ADH) est mesurée à 340 nm. CH 3 CH 2

OH + NAD

CH 3

CHO + NADH + H

3

Réactifs:

Réactifs Composition Concentrations des solutions R1 pyrophosphate semicarbazide glycine

75 mmol.L

-1 pH 8,7

75 mmol.L

-1

21 mmol.L

-1

R2 NAD

24 mmol.L

-1

R3 Alcool déshydrogénase environ 8000 U.mL

-1

Standards éthanol

S50 S100 S200 S300

50 mg.L

-1

100 mg.L

-1

200 mg.L

-1

300 mg.L

-1

2.2.1. Mode opératoire

Diluer le distillat D au 1/50 en fiole jaugée à 50 mL Réaliser en tube à essais les mélanges suivants :

Témoin S50 S100 S200 S300 Essais

R1 4,80 mL 4,80 mL 4,80 mL 4,80 mL 4,80 mL 4,80 mL R2 0,10 mL 0,10 mL 0,10 mL 0,10 mL 0,10 mL 0,10 mL eau distillée 0,10 mL - - - - -

S50 - 0,10 mL - - - -

S100 - - 0,10 mL - - -

S200 - - - 0,10 mL - -

S300 - - - - 0,10 mL -

distillat D dilué au 1/50 - - - - - 0,10 mL

Bien mélanger

R3 0,02 mL 0,02 mL 0,02 mL 0,02 mL 0,02 mL 0,02 mL Bien mélanger à nouveau, boucher les tubes avec du Parafilm® et les placer 30 min dans un bain thermostaté à 37°C Lire les absorbances des standards et des essais à 340 nm contre le témoin

2.2.2. Résultats

Tracer la courbe d'étalonnage de la méthode : A340nm = f (c standard) Déterminer la concentration massique en éthanol : du distillat D du vin En déduire le degré alcoolique du vin en pourcentage en volume (V/V)

Données :

Ethanol : CH

3 CH 2

OH ; M = 46 g.mo1

-1

Masse volumique de l'éthanol : 0,7936 kg.L

-1

à 15°C

4

2.3. Mesure de l'activité de l'alcool déshydrogénase utilisée dans cette méthode

L'ADH est une déshydrogénase à zinc, NAD

dépendante.

2.3.1. Réactifs

Tampon Tris-HCl 20 mmol.L

-1 , pH 8,8 : Tp Tris pH8,8

Réactif R3 dilué au 1/250 : ADH/250

Ethanol à 0,1 % (V/V) : substrat S

NAD

10 mmol.L

-1 NAD Tous les réactifs sont préparés en tampon Tris.

Tampon Tris, éthanol et NAD

se conservent à température ambiante.

2.3.2. Mode opératoire

Réaliser un essai

Introduire dans un tube à hémolyse

Solution de NAD

10 mmol.L

-1 NAD

0,50 mL

Solution éthanol à 0,1 % substrat S 2,00 mL

Tampon Tris-HCl 20 mmol.L

-1 , pH 8, 8 Tp Tris pH8,8 0,40 mL

Préincuber 5 min à 30°C

Déclencher la réaction en ajoutant :

Réactif R3 dilué au 1/250 ADH/250 0,100 mL

Homogénéiser rapidement

Transvaser dans une cuve de lecture UV

Suivre la variation d'absorbance à 340 nm pendant 2 minutes Les lectures d'absorbance seront faites contre l'eau distillée.

2.3.3. Résultats

Tracer le graphe A340nm = f (temps)

Déterminer la pente de la courbe en UA.s

-1 Calculer la concentration d'activité catalytique de la solution d'ADH en µkat.L -1 et en U.L -1

Données:

NADH à 340 nm = 630 m

2 .mol -1

1 kat : 1 mole substrat transformé par seconde

1 U : 1 µmole de substrat transformé par minute

5

3. CONTROLES SANITAIRES

3.1. Contrôle de propreté microbiologique : identification d'un contaminant bactérien

Ce contaminant a été récupéré sur la paroi interne d'une cuve vide, après lavage de celle-ci.

Après purification, il a été repiqué sur gélose ordinaire.

3.1.1. Tests d'orientation

Réaliser les tests nécessaires à l'orientation de cette souche et formuler une demande de milieux en vue de son identification.

3.1.2. Galerie d'identification

Ensemencer la galerie fournie par les examinateurs (fiche technique jointe à la galerie).

3.1.3. Résultat

Après 4 h d'incubation, lire la galerie, identifier le contaminant et conclure.

3.2. Médecine du travail

Le personnel travaillant dans les cuveries peut être exposé à des faibles teneurs en alcool mais

constantes pouvant engendrer des troubles hématologiques semblables à ceux dus à un alcoolisme chronique :

présence de macrocytes, éventuellement anémie modérée pouvant être due à des auto-

anticorps, leucopénie modérée et transitoire, thrombopénie. Un contrôle régulier est effectué sur le sang de deux personnes (Monsieur X et Monsieur Y) afin de détecter d'éventuelles anomalies sanguines.

3.2.1. Des examens hématologiques sont pratiqués sur le sang de Monsieur X.

Les résultats partiels de l'hémogramme réalisé sont rassemblés sur le document 2. Calculer les constantes érythrocytaires de Monsieur X. Analyser les résultats de Monsieur X et conclure.

3.2.2. On dispose d'un frottis coloré par la

technique de May-Grünwald Giemsa obtenu à partir du sang de Monsieur X.

Faire un examen cytologique de ce sang.

Déterminer la formule leucocytaire de Monsieur X à partir de l'identification de 100 leucocytes. Exprimer le résultat en % et en nombre de cellules par litre de sang. Conclure à l'aide des données du document 3. 6

3.2.3. Les résultats de l'hémogramme pratiqué sur le sang de Monsieur Y ont montré une

anémie macrocytaire. Le médecin demande une recherche d'auto-anticorps anti-érythrocytaires (anticorps dirigés contre les hématies de l'individu). Réaliser cette recherche sur les hématies de Monsieur Y et sur les hématies témoins fournies en utilisant le protocole opératoire présenté sur le document 4. La technique utilisée est une réaction d'agglutination (test de Coombs direct). Lire et discuter les résultats obtenus pour les tubes 1, 2, 3 et 4.

Lire le tube 5 et conclure.

7

DOCUMENT 1

DOCUMENT 1

8

DOCUMENT 2

EXTRAIT DE L'HEMOGRAMME DE MONSIEUR X.

Normes Résultats de

Monsieur X

femme homme

Numération des

érythrocytes

5,07 . 10

12 . dm -3

4,00 à 5,00 . 10

12 . dm -3

4,50 à 5,50 . 10

12 . dm -3

Dosage de

l'hémoglobine

154 g. dm

-3

120 à 160 g. dm

-3

140 à 180 g. dm

-3

Hématocrite

0,45 L/L

0,35 à 0,47 L/L

0,40 à 0,54 L/L

VGM

80 à 100 fL

TCMH

27 à 32 pg

CCMH

300 à 360 g. dm

-3

Numération des

leucocytes

6,0 . 10

9 . dm -3

4,0 à 10,0 . 10

9 . dm -3

Numération des

thrombocytes

325 . 10

9 . dm -3

150 à 500 . 10

9 . dm -3 9

DOCUMENT 3

FORMULE LEUCOCYTAIRE DE L'ADULTE SAIN

(Selon Jean Bernard)

Cellules % Nombre absolu par L (x10

9

Granulocytes ou polynucléaires

neutrophiles

45 à 70

1,7 à 7

Granulocytes ou polynucléaires

éosinophiles

1 à 5

0,05 à 0,5

Granulocytes ou polynucléaires

basophiles

0 à 0,5

0,01 à 0,05

Lymphocytes

20 à 40

1,5 à 4

Monocytes

3 à 10

0,1 à 1

10

DOCUMENT 4

RECHERCHE D'AUTO-ANTICORPS ANTI-ERYTHROCYTAIRES

(Test de COOMBS direct)

1. PRODUITS ET REACTIFS FOURNIS

1.1. Produit biologique testé = hématies de Monsieur Y

Le sang veineux doit avoir été prélevé sur anticoagulant (EDTA ou CITRATE) depuis moins

de deux heures. Les hématies, séparées du plasma par centrifugation, doivent être lavées 6

fois en eau physiologique. Les hématies lavées sont fournies en suspension à 5% en eau physiologique (GR.Y).

1.2. Sérum anti-globulines humaines = Sérum de Coombs

Ce réactif contient un mélange d'anticorps anti-Ig G humaines.

1.3. Hématies tests

Hématies O Rhésus négatif (D négatif) et O Rhésus positif (D positif), lavées six fois en eau

physiologique et mises en suspension à 5 % en eau physiologique. Elles servent à la préparation des hématies témoins : - Hématies O Rhésus négatif incubées avec un sérum anti-D (IgG), - Hématies O Rhésus positif incubées avec un sérum anti-D (IgG). Les hématies ainsi préparées sont fournies en suspension à 5% en eau physiologique : - suspension d'hématies O Rh - (O Rh-) - suspension d'hématies O Rh + (O Rh+)

1.4. Sérum témoin négatif (salin) = Sérum AB neutre

On utilise du sérum humain provenant d'un sujet de groupe AB, non enrichi en albumine (sérum AB neutre), qui ne contient ni anticorps irréguliers anti-érythrocytes, ni anticorps anti-A ou anti-B. 11

2. REALISATION DU TEST DE COOMBS DIRECT

NUMÉRO DES

TUBES

1 2 3 4 5

HÉMATIES

TESTÉES (GR)

suspension saline à

5% GR O Rh -

(préalablement incubés avec sérum anti-D)

GR O Rh +

(préalablement incubés avec sérum anti-D)

HÉMATIES

DU PATIENT

(GR Y) HÉMATIES

DU PATIENT

(GR Y) HÉMATIES

DU PATIENT

(GR Y)

Volume (µL)

50
50
50
50
50

ANTIGLOBULINE =

Sérum de Coombs

volume (µL) 100
100
100

SÉRUM AB NEUTRE

volume (µL) 100
EAU

PHYSIOLOGIQUE

volume (µL) 100
Mélanger - Centrifuger 1 min à 1000 trs/min - Lire

La lecture est macroscopique.

En roulant doucement le tube, incliné à l'horizontale sur fond blanc, noter l'absence ou la présence d'agglutinats.

Remarque :

Dans certains cas la présence d'un surnageant coloré indique une hémolyse et donc une réaction positive.quotesdbs_dbs50.pdfusesText_50

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