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de biologie moléculaire

Abderrahman Maftah

Professeur à l'université de Limoges

Jean-Michel Petit

Professeur à l'université de Limoges

Raymond Julien

Professeur émérite à l'université de Limoges

Cours + QCM/QROC

4 e

édition

9782100773688-Livre.fm Page I Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

Les illustrations de cet ouvrage ont été réalisées par Sé bastien ARICO.

Directeur dÕouvrage

Raymond JULIEN

© Dunod, Paris, 2007, 2011, 2015, 2018

11, rue Paul Bert, 92210 Malakoff

www.dunod.com

ISBN 978-2-10-077368-8

9782100773688-Livre.fm Page II Dimanche, 22. octobre 2017 5:00 17

Table des matières

1Structure de l'ADN et de l'ARN 1

1.1 Les composants des acides nucléiques 1

La structure des nucléotides 3

La structure des polynucléotides 5

1.2 La structure en double hélice de l'ADN 5

La règle de Chargaff et les appariements complémentaires 5

Les différentes formes d'ADN 8

Dissociation et réassociation des brins d'ADN 9

Les surenroulements de l'ADN 11

1.3 Le nucléosome, la chromatine et les chromosomes 13

La structure du nucléosome 13

La structure et le remodelage de la chromatine 15

La structure des chromosomes et le cycle cellulaire 16

1.4 La structure des génomes 19

Qu'est-ce qu'un génome ? 19

La taille des génomes 19

Les génomes viraux 21

Les génomes procaryotes 21

Les génomes eucaryotes 21

Les génomes d'organites 22

1.5 Les différents types d'ARN 23

Structure et fonction 23

Qu'est-ce qu'un ARN non codant ? 25

Qu'est-ce que l'ARN interférence ? 26

Points clefs 28

QCM - QROC 29

Réponses 31

9782100773688-Livre.fm Page III Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

IVBiologie molŽculaire

2Réplication, réparation, recombinaison et transposition

de l'ADN 33

2.1 Les mécanismes de réplication de l'ADN 33

La chimie de synthèse cellulaire

des polydésoxyribonucléotides 34

L'action de l'ADN polymérase 35

La fourche de réplication 36

Les autres enzymes et protéines de la réplication 37

Les différentes ADN polymérases 40

Les différentes étapes de la réplication 41

2.2 Les erreurs de réplication de l'ADN et leur réparation 46

Les altérations de la structure de l'ADN 47

Les mécanismes de réparation 48

2.3 Les détériorations environnementales de l'ADN

et leur réparation 50 L'hydrolyse spontanée et les détériorations physico- chimiques 50

Les agents intercalants 51

La réparation des détériorations 51

2.4 La recombinaison et la transposition de l'ADN 54

Les mécanismes de recombinaison homologue 54

La recombinaison en des sites spécifiques

et la transposition 61

Points clefs 69

QCM - QROC 70

Réponses 72

3La transcription de l'ADN 75

3.1 Les mécanismes de la transcription 75

Les ARN polymérases 75

Les différentes étapes de la transcription 77

3.2 La transcription chez les bactéries 78

Les promoteurs bactériens 78

Le démarrage de la transcription 79

La phase d'allongement 79

L'arrêt de la transcription 81

9782100773688-Livre.fm Page IV Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

Table des matièresV

3.3 La transcription chez les eucaryotes 82

Les promoteurs eucaryotes et la polymérase II 82 Le démarrage : facteurs de transcription et complexe médiateur 83

Les phases d'allongement et d'arrêt 86

Les modifications des transcrits 86

Les deux autres polymérases eucaryotes 89

3.4 LÕŽpissage de lÕARN 90

Le mécanisme général 90

Le splicéosome 93

L'épissage alternatif et sa régulation 93

Exemples de rôles biologiques de l'épissage alternatif 95

3.5 LÕÇ editing des transcrits È 96

Points clefs

99

QCM - QROC 101

RŽponses 102

4La traduction des ARN messagers 105

4.1 Le code gŽnŽtique 106

Le code génétique est dégénéré 106 Le code a été établi expérimentalement 108 Le code est lu sur l'ARN messager dans le sens 5'-3' 108

Les codons ne sont pas chevauchants 109

Les mutations modifiant le sens des codons 109

Le code génétique est universel 111

4.2 Les principaux acteurs de la traduction 111

Les ARN messagers 112

Les ARN de transfert 112

Le ribosome 116

4.3 La traduction des ARN messagers bactŽriens 120

Le démarrage (initiation) de la traduction 120

L'étape d'allongement (élongation) de la chaîne polypeptidique 122

L'arrêt de la synthèse (terminaison) 125

9782100773688-Livre.fm Page V Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

VIBiologie molŽculaire

4.4 La traduction des ARN messagers eucaryotes 125

Le démarrage de la traduction eucaryote 125

Les étapes d'allongement et d'arrêt de la traduction eucaryote 128 Traduction et demi-vie des ARN messagers eucaryotes 128

Points clefs 131

QCM - QROC 132

Réponses 135

5Régulation de l'expression des gènes 139

5.1 Principes généraux 139

Les protéines régulatrices : activateurs et répresseurs 139

Le recrutement des ARN polymérases 140

Autres exemples de facteurs de régulation 141

5.2 Régulation chez les procaryotes 142

L'exemple historique : l'opéron lactose 142

Autres exemples 147

La régulation complexe du cycle vital

du bactériophage l 151

5.3 Régulation chez les eucaryotes 156

Les régulateurs transcriptionnels 157

Le contrôle des régulateurs transcriptionnels 161 Le contrôle de l'épissage alternatif des transcrits ARN 164

5.4 Régulation traductionnelle de l'expression

des gènes eucaryotes 165 Éléments de structure des ARN messagers influençant la traduction 166 Le contrôle général par la phosphorylation des facteurs de démarrage 167 Les mécanismes spécifiques régulant l'attachement du ribosome à l'ARN messager 169 Les mécanismes de régulation plus tardifs 170 Les mécanismes de régulation de la traduction par les micro-ARN 170

9782100773688-Livre.fm Page VI Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

Table des matièresVII

L'irrésistible ascension de l'ARN comme régulateur de l'expression des gènes 174

Points clefs 177

QCM-QROC 179

RŽponses 182

6Techniques de biologie molŽculaire 185

6.1 La crŽation de molŽcules dÕADN recombinant 185

Couper l'ADN : les enzymes de restriction 185

Ligaturer l'ADN 187

6.2 Les vecteurs de clonage 189

Les plasmides 190

Les vecteurs viraux 193

Les cosmides 193

Les chromosomes artificiels bactériens 194

Les vecteurs pour levures 194

Les vecteurs pour les eucaryotes supérieurs 196

6.3 Les banques dÕADN 196

Les banques d'ADN génomique 196

Les banques d'ADN complémentaire 197

6.4 Les techniques dÕanalyse de lÕADN 197

Le séquençage des acides nucléiques 197

Les nouvelles techniques de séquençage 201

Application au séquençage de l'ARN 203

Application à la métagénomique 205

Une nouvelle révolution dans le séquençage 207 La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 210

La PCR quantitative en temps réel 210

Les techniques d'hybridation des acides nucléiques 213 Les techniques de localisation des sites de liaison à l'ADN 215

6.5 Le criblage de cellules recombinŽes 217

Criblage par PCR 217

Criblage à l'aide de sites de restriction 218

9782100773688-Livre.fm Page VII Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

VIIIBiologie molŽculaire

6.6 Les applications de la technologie de l'ADN recombinant 219

La mutagenèse 219

Le système double-hybride 223

Transfert et expression de gènes eucaryotes

chez les procaryotes 224 Transfert et expression de gènes dans les levures 228 Génie génétique et cellules eucaryotes supérieures 229 Utilisation de vecteurs rétroviraux pour la transfection des cellules 231 Les gènes rapporteurs et études des séquences promotrices 232 Un nouvel outil remarquable d'ingénierie des génomes : le système CRISPR-Cas 9 235

Les techniques d'analyse de l'épigénome 239

Points clefs 241

QCM-QROC 243

Réponses 246

Glossaire 249

Index 259

9782100773688-Livre.fm Page VIII Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

1

Structure

de lÕADN et de lÕARN Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont des macromolécules compo- sées d'un enchaînement d'unités structurales appelées nucléotides.

Ce sont donc des polynucléotides.

À l'état libre, chaque nucléotide est constitué : d'une base (Fig. 1-1), qui peut être une purine (composée de deux hétérocycles azotés) ou une pyrimidine (un seul hétérocycle azoté) ; d'un pentose (ose à cinq atomes de carbone, Fig. 1-2) ; d'un à trois groupes phosphate (Fig. 1-3). Les atomes des bases (C et N) portent les chiffres 1 à 6 pour les pyrimidines et 1 à 9 pour les purines, alors que les atomes C du pentose portent les chiffres 1' à 5'. Le signe prime ajouté à ces derniers les distingue de ceux des bases. L'ose, par son carbone 1', établit une liaison N-glycosidique avec l'azote 1 des pyrimidines ou l'azote 9 des purines. Par son carbone 5', il forme une liaison ester avec un premier groupe phosphate (désigné pour cette raison phos- phate a). Ce dernier peut former des liaisons anhydride d'acide (Fig. 1-3) avec des groupes phosphate b et g ou des liaisons ester avec un groupe OH porté par le carbone 3' du pentose précédent (Fig. 1-4). PLAN

1.1 Les composants des acides nuclŽiques

1.2 La structure en double hŽlice de lÕADN

1.3 Le nuclŽosome, la chromatine et les chromosomes

1.4

La structure des gŽnomes

1.5

Les diffŽrents types dÕARN

OBJECTIFS

DŽÞnir les structures chimiques des acides nuclŽiques, notamment celle de la double hŽlice de lÕADN RŽpertorier dÕun point de vue structural et fonctionnel les diffŽrents types dÕARN

9782100773688-Livre.fm Page 1 Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

2Chapitre 1 • Structure de lÕADN et de lÕARN

L'union d'une base et d'un pentose s'appelle un nucléoside. Dès qu'un groupe phosphate est présent, l'ensemble est désigné par le terme nucléotide. Il en résulte toute une nomenclature dont un exemple est donné (Fig. 1-3). Figure 1-1 Structures chimiques des bases puriques (Adénine, Guanine) et des bases pyrimidiques (Cytosine, Thymine, Uracile) des acides nucléiques ADN et ARN. Des formes méthylées peuvent aussi être rencontrées (5-méthyl cytosine).

Cytosine

(2 oxo, 4 aminopyrimidine)Thymine (5méthyl-uracile) 123
4 5 6 C C C CN N N H H H HO C C C CN NC H O H O H3 123
4 5 6

Uracile

(2,4 dioxopyrimidine) C C C CN NH H O H O 123
45
6

Adénine

(6 aminopurine) C C C CN NN C NH H 1 2 345
67
8 9 N HH

Guanine

(2 amino, 6 oxopurine) C C CCN N NH HN C NH 1 2 345
67
8 9 O

5 méthyl-cytosine

C C C CN NH 3 C H O 123
45
6 N HH H

9782100773688-Livre.fm Page 2 Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

1.1 • Les composants des acides nuclŽiques3

La structure des nucléotides

Dans l'ADN, l'ose est le 2'-désoxyribose (Fig. 1-2) et les nucléotides sont des désoxyribonucléosides monophosphates (Fig. 1-4). Ils ne comportent qu'un seul groupe phosphate (le phosphate a) ; Les bases puriques de l'ADN sont l'adénine et la guanine. Les bases pyrimidiques de l'ADN sont la cytosine et la thymine (Fig. 1-1). Figure 1-2 Les deux pentoses respectifs de lÕARN et de lÕADN. Figure 1-3 Structure dŽtaillŽe dÕun dŽsoxyribonuclŽoside triphosphate. En remplaant la lettre A (AdŽnine) par les lettres G, C, T/U et le dŽsoxyribose par le ribose, la nomenclature est gŽnŽralisable ˆ tous les nuclŽotides de lÕADN et de lÕARN. CC CCO

HCH OH

2 HOH OH H HH 1' 2'

3'4'5'

-D- dŽsoxy ribose-D-ribose CC CCO

HCH OH

2 HOH OH H OHH 1'

2'3'4'5'

C C CCN NN C NH H 1 2 345
6 7 8 9 N HH CO C CC OHH HH HC H H PO O PO O PO O OOO O---- 1' 2'

3'4'5'

Base (A)

DŽsoxyribonuclŽoside (dA)

DŽsoxyribonuclŽoside 5' monophosphate (dAMP)

DŽsoxyribonuclŽoside 5' diphosphate (dADP)

DŽsoxyribonuclŽoside 5' triphosphate (dATP)

9782100773688-Livre.fm Page 3 Mercredi, 15. novembre 2017 6:13 18

4Chapitre 1 • Structure de lÕADN et de lÕARN

Dans l'ARN, l'ose étant un ribose (Fig. 1-2), les nucléotides sont des ribonucléosides monophosphates. Dans l'ARN, l'uracile remplace la thymine. Dans l'ADN, la cytosine peut être méthylée sur le carbone 5 pour donner la 5-méthyl-cytosine (Fig. 1-1). Les cytosines méthylées sont souvent présentes dans des régions de séquences ADN Figure 1-4 Principe de la formation d'un brin d'ADN par la polymérisation des nucléotides. Noter que le brin matrice qui est normalement copié n'est pas ici représenté. a) représentation développée ; b) représentation simplifiée. O C HH 3' O CC C HH HC H PO O O O 5' A CO C C CHquotesdbs_dbs28.pdfusesText_34

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