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Université de Montréal

RÔLE DES NEUTROPHILES DANS L"INFLAMMATION ALLERGIQUE ASSOCIÉE AU SOUFFLE

CHEZ LE CHEVAL, UN MODÈLE NATUREL D"ASTHME

par

ANOUK LAVOIE-LAMOUREUX

Département des sciences cliniques

Faculté de médecine vétérinaire

Thèse présentée à la Faculté de médecine vétérinaire en vue de l"obtention du grade de Philosophae Doctor (Ph.D.) en sciences vétérinaires

Avril, 2011

© Anouk Lavoie-Lamoureux, 2011

ii

Université de Montréal

Faculté de médecine vétérinaire

Cette thèse intitulée

RÔLE DES NEUTROPHILES DANS L"INFLAMMATION ALLERGIQUE ASSOCIÉE AU SOUFFLE CHEZ

LE CHEVAL, UN MODÈLE NATUREL D"ASTHME

présentée par

Anouk Lavoie-Lamoureux

a été évaluée par un jury composé des personnes suivantes

Marcelo Gottschalck, président-rapporteur

Jean-Pierre Lavoie, directeur de recherche

James G Martin, codirecteur

Mariela A. Segura, membre du jury

Élyse Bissonnette, examinatrice externe

Daniel Jean, représentant du doyen de la FES

iii

Résumé

L"asthme chez l"homme et le souffle chez le cheval sont des maladies inflammatoires chroniques des voies respiratoires partageant plusieurs caractéristiques physiopathologiques dont la bronchoconstriction réversible, l"inflammation des voies respiratoires inférieures,

l"hyperréactivité bronchique et le remodelage tissulaire. Les phénotypes cliniques d"asthme se

caractérisent en partie selon le type d"inflammation affectant les voies respiratoires et la

présence ou non d"allergie. Le souffle chez le cheval s"avère être un modèle adapté pour l"étude

des mécanismes impliqués dans l"asthme neutrophilique, lesquels demeurent particulièrement mal compris, en contraste avec ceux associés avec l"asthme éosinophilique. La réponse immunologique sous-jacente au souffle implique entre autres l"expression de cytokines de type

Th2, suggestives d"une réponse allergique (immunité acquise). La poussière environnementale

qui provoque les symptômes du souffle contient également des agents non-spécifiques dérivés

de bactéries, champignons et moisissures, susceptibles d"activer des mécanismes immunitaires innés chez les chevaux atteints du souffle.

Nous avons étudié le rôle des neutrophiles dans l"inflammation associée à la réponse

innée et acquise chez le cheval atteint du souffle. Dans un premier temps, l"effet de produits

dérivés de bactéries sur l"activation des neutrophiles sanguins provenant de chevaux normaux

et atteints de souffle a été étudié dans le but d"évaluer la contribution de la réponse innée dans

la physiopathologie du souffle. Nous avons évalué l"effet de l"IL-4, une cytokine de type Th2,

sur les neutrophiles des deux groupes de chevaux afin d"évaluer de quelle manière le

neutrophile peut participer à la réponse acquise associée à la réponse allergique. Finalement,

nous avons étudié l"expression des isoformes de l"arginase par les neutrophiles équins car cette

enzyme métabolise la L-arginine et est potentiellement impliquée dans le bronchospasme et le remodelage tissulaire associés à l"asthme. Nos résultats suggèrent que les neutrophiles et les mononucléaires sanguins isolés des

chevaux atteints du souffle possèdent une réponse inflammatoire exagérée en réponse aux

lipopolyssacharides et peptides formylés et surexpriment les cytokines pro-inflammatoires IL-

1ʑ, TNF et IL-8. Cette réponse innée aberrante est associée à une inflammation systémique

caractérisée par des concentrations sériques élevées de TNF chez les chevaux atteints du

souffle en période de rémission clinique. De plus, nos résultats montrent que l"IL-4 active le

neutrophile équin et favorise son chimiotactisme de manière autocrine. L"IL-4 induit un iv

phénotype d"activation typique dans le neutrophile équin, caractérisé par l"expression accrue

de cytokines pro-inflammatoires (IL-8 et TNF) ainsi que de récepteurs potentiellement

1 n"est pas un marqueur de l"activation des neutrophiles équins par l"IL-4, mais que ces cellules

expriment constitutivement l"isoforme 2 fonctionnelle de l"arginase. La surrégulation des deux isoformes au niveau des poumons périphériques semble être associée à la pathologie du souffle, ce qui est en accord avec les modèles d"asthme chez la souris, le rat et le cobaye. L"ensemble de ces travaux suggère que les neutrophiles puissent agir comme cellules effectrices importantes de la réponse innée et acquise dans la pathophysiologie du souffle, un modèle naturel d"asthme neutrophilique.

Mots-clés : neutrophiles, souffle, asthme, réponse immunitaire innée, réponse allergique,

cytokines de type Th2, arginase, cytokines pro-inflammatoires, inflammation systémique, phénotype cellulaire v

Abstract

Human asthma and equine heaves are chronic pulmonary diseases sharing several pathophysiological properties including lower airway inflammation, reversible bronchoconstriction, bronchial hyperresponsiveness, and tissue remodeling. Clinical phenotypes of asthma are characterized in part by the inflammatory cell populations infiltrating the airways, and the presence or absence of allergy. Heaves is a suitable animal model for the study of the poorly defined pathophysiological processes leading to airway neutrophilia. The immune response in heaves involves Th2 cytokine expression, which is, among other features, associated to allergic inflammation (acquired immunity). Environmental dust exposure leading to clinical exacerbation of heaves contains non-specific agents derived from bacteria, molds or fungi which could also activate innate immune responses in heaves affected horses. We studied the role of neutrophils in innate and acquired immune responses in heaves affected-horses. First, innate immune responses of neutrophils isolated from normal and heaves-affected horses to bacterial-derived products were studied. We also assessed the effect of IL-4, a Th2 cytokine, on equine neutrophils isolated from both groups of horses. Finally, we evaluated the arginase isoforms expressed by equine neutrophils as this enzyme that takes part to the L-arginine metabolism and is thought to contribute to bronchospasm and tissue remodeling associated with asthma. Our results suggest that both neutrophils and mononuclear cells from heaves-affected horses, when compared to healthy horses, have an excessive inflammatory response to lipopolyssacharides and formylated peptides, characterized by increased IL-1ʑ, IL-8 and TNF expression. This altered innate response was associated with systemic inflammation in asymptomatic susceptible horses as high serum TNF concentrations were detected. Furthermore, we found that equine neutrophils are activated by IL-4 and release neutrophil chemotactic factors in response to this cytokine. IL-4 also induces a distinctive activation phenotype in neutrophils that is characterized by increased expression of pro-inflammatory response. Finally, we showed that arginase 1 is not a marker of IL-4-activated equine neutrophils although they constitutively express the functionally active isoform 2 of the enzyme. The up-regulation of arginase isoforms in the peripheral lungs of horses with heaves suggests a role for arginase in this model, as it is described in the mouse, rat and guinea pig vi models. Taken together, this work suggest that neutrophils could play an important role in both innate and acquired immune responses associated with heaves pathophysiology, a natural model of neutrophilic asthma. Keywords : neutrophils, heaves, asthma, innate immunity, allergic response, Th2-type cytokines, arginase, pro-inflammatory cytokines, systemic inflammation, cellular phenotype vii

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................................ iii

Abstract ............................................................................................................................................ v

Table des matières ......................................................................................................................... vii

Liste des tableaux ............................................................................................................................ xi

Liste des figures .............................................................................................................................. xii

Liste des abréviations ..................................................................................................................... xv

Remerciements ............................................................................................................................. xix

Introduction ..................................................................................................................................... 1

Recension des écrits ....................................................................................................................... 5

Maladies inflammatoires chroniques des voies respiratoires : mécanismes impliqués ............. 6

Caractéristiques anatomiques et physiologiques du poumon ............................................... 7

Chez l"homme ..................................................................................................................... 7

Particularités chez le cheval ............................................................................................... 9

Système de défense pulmonaire .......................................................................................... 12

Mécanismes de défense immunitaire innés .................................................................... 12

Mécanismes physico-chimiques .................................................................................. 12

Mécanismes immunologiques ..................................................................................... 13

La réponse inflammatoire........................................................................................ 13

Les cytokines pro-inflammatoires ....................................................................... 15

Toll-like Receptors (TLRs) ............................................................................................. 19

Récepteur des peptides formylés (FPR) ....................................................................... 20

Cellules épithéliales ...................................................................................................... 22

Macrophages................................................................................................................ 24

Cellules métachromatiques : mastocytes et basophiles .............................................. 26

Neutrophiles ................................................................................................................ 29

Granulopoïèse, granules et processus de dégranulation ........................................ 29

Recrutement ............................................................................................................ 33

Roulement, adhésion ferme, transmigration et molécules impliquées. ............. 33 Mécanismes de migration du neutrophile : changements morphologiques,

chimiokines et autres agonistes .......................................................................... 37

viii Expression par les neutrophiles de récepteurs associés à la réponse immunitaire

innée ........................................................................................................................ 40

Les neutrophiles tissulaires ..................................................................................... 42

Production de cytokines et chimiokines par les neutrophiles ................................. 43

TNF ...................................................................................................................... 44

IL-1ʑ ..................................................................................................................... 45

IL-8 (CXCL8) .......................................................................................................... 45

Particularités du neutrophile équin .................................................................... 46

Apoptose .................................................................................................................. 47

Mécanismes de l"apoptose spontanée chez le neutrophile ................................ 47

La réponse immunitaire acquise: ..................................................................................... 52

Cellules dendritiques .................................................................................................... 52

Différents types de cellules dendritiques ................................................................ 52

Activation des cellules dendritiques : tolérance versus activation de la réponse

immunitaire ............................................................................................................. 53

Lymphocytes ................................................................................................................ 55

Lymphocytes B ......................................................................................................... 55

Particularités du cheval ....................................................................................... 56

Lymphocytes T ......................................................................................................... 56

Th1 et réponse à médiation cellulaire ................................................................. 56

Th2, réponse humorale et allergie ...................................................................... 57

Th17 ..................................................................................................................... 58

Treg ...................................................................................................................... 59

Résolution de l"inflammation ........................................................................................... 60

Égression des leucocytes.............................................................................................. 60

Processus de cicatrisation normale ............................................................................. 60

Effet de l"inflammation chronique sur la fonction respiratoire ....................................... 62

Remodelage tissulaire .................................................................................................. 62

Asthme : définition par phénotypes cliniques ...................................................................... 64

L"asthme extrinsèque: hypersensibilité de type I et atopie ............................................. 66

L"asthme intrinsèque et mécanismes impliqués .............................................................. 67

Autres spécifications et terminologies par rapport à l"asthme sévère ............................ 69

ix

Phénotypes cliniques basés sur le type d"inflammation .................................................. 69

Le rôle de l"immunité innée dans l"asthme allergique et "l"hypohtèse de l"hygiène" ..... 71

Génétique de l"asthme ..................................................................................................... 74

Le métabolisme de la L-arginine dans l"asthme ............................................................... 76

Les neutrophiles et le métabolisme de la L-arginine chez l"homme ........................... 79 Production d"oxyde nitrique (NO) par les neutrophiles .......................................... 80

Particularités du neutrophile équin .................................................................... 81

Inflammation systémique associée à l"asthme ................................................................ 81

Les neutrophiles dans l"asthme : effecteurs de la réponse allergique ou de la réponse

innée? ............................................................................................................................... 81

Le Souffle comme modèle d"asthme neutrophilique ........................................................... 85

Définition : historique et caractéristiques cliniques ........................................................ 85

Histopathologie et remodelage tissulaire .................................................................... 87

Principaux traitements ................................................................................................. 88

Les causes du souffle ........................................................................................................ 88

Allergènes..................................................................................................................... 89

Agents non-spécifiques ................................................................................................ 91

Génétique et facteurs de risque .................................................................................. 93

Les neutrophiles, potentielles cellules effectrices de la réponse inflammatoire associée au

souffle ................................................................................................................................... 94

Neutrophiles périphériques ............................................................................................. 95

Neutrophiles pulmonaires ................................................................................................ 95

Retour sur les objectifs de la thèse ........................................................................................... 97

Méthodologie et Résultats ........................................................................................................... 98

Article #1 Systemic inflammation and priming of peripheral blood leukocytes persist during

clinical remission in horses with heaves ........................................................................................ 99

Article #3 IL-4 activates equine neutrophils and induces a mixed inflammatory cytokine

expression profile with enhanced neutrophil-chemotactic mediator release ex vivo ................. 150

Article #4 Neutrophilic inflammation and airway obstruction in equine asthma is associated with

elevated expression of arginase isoforms 1 and 2. ..................................................................... 186

Discussion générale .................................................................................................................... 214

x

Conclusions générales et Perspectives ........................................................................................ 238

Bibliographie ................................................................................................................................ 241

Lexique ............................................................................................................................................. I

Annexe 1 Table de nomenclature des chimiokines et de leurs récepteurs .................................... II

Annexe 2 Mesure de la fonction respiratoire chez le cheval ......................................................... IV

Annexe 3 Articles rédigés à titre de co-auteur .............................................................................. VII

Article #5 Heaves, an asthma-like disease of horses ............................................................... VIII

Article #6 Effect of Long-Term Fluticasone Treatment on Immune Function in Horses with

Heaves .................................................................................................................................... XXIX

Article #7 Effect of Antigen Exposure on Airway Smooth Muscle Remodeling in an Equine

Model of Chronic Asthma ..................................................................................................... XXXIX

Article #8 Genomic and non-genomic effects of dexamethasone on equine peripheral blood

neutrophils ............................................................................................................................ XLVII

Article #9 IL-4 stimulates the expression of CXCL-8, E-selectin, VEGF, and inducible nitric oxide

synthase mRNA by equine pulmonary artery endothelial cells ................................................ LIV

Curriculum vitae ......................................................................................................................... LXIV

xi

Liste des tableaux

Tableau I. Comparatif des volumes pulmonaires (en L) chez le cheval et chez l"homme de taille

moyenne. .............................................................................................................................. 11

Tableau II. Protéines membranaires et solubles des granules du neutrophile ............................ 31

Tableau III. Cytokines et chimiokines produites par le neutrophile humain. ............................... 43

Tableau IV. Phénotypes cliniques d"asthme. ................................................................................ 65

Tableau V. Similarités et différences entre l"asthme et le souffle. ............................................... 94

Article #1

Table 1. Differential cell counts in neutrophil-depleted isolation fraction....................................

.124

Article #2

Table 1

conditions using manufacturer"s instructions......................

Article #3

Table 1. P values corresponding to the effect of treatment with reqIL-4, antigenic challenge and

disease on relative gene expression by PBN.......................................................................................183

Tableau VI. Phénotype et caractéristiques des macrophages activés ........................................ 230

Tableau VII. Comparaison inter-espèce de l"expression des isoformes de l"arginase par les

neutrophiles ........................................................................................................................ 231

xii

Liste des figures

Figure 1. Anatomie comparée des poumons de l"homme (A), du cheval (B) et de la souris (C). ....... 8

Figure 2. Anatomie comparée des voies supérieures chez l"homme et le cheval. ........................... 10

Figure 3. Respiration biphasique chez le cheval, comparaison avec l"homme. ................................ 12

Figure 4. Superfamille du récepteur au TNF ..................................................................................... 16

Figure 5. Inflammasome et sécrétion d"IL-1ʑ. .................................................................................. 18

Figure 6. Récepteurs Toll-like (TLRs). ................................................................................................ 20

Figure 7. Récepteur du fMLP (FPR) ................................................................................................... 22

Figure 8. Activation et recrutement des cellules dendritiques par les cellules épithéliales. ............ 24

Figure 9. Différents types d"activation des macrophages. ................................................................ 26

Figure 10. Localisation des mastocytes pulmonaires : comparaisons inter-espèces. ....................... 27

Figure 11. Granulopoïèse chez le neutrophile. ................................................................................. 30

Figure 12. Molécules d"adhésion et transmigration. ........................................................................ 34

Figure 13. Morphologie polarisée du neutrophile activé.................................................................. 35

Figure 14. Récepteurs couplés aux protéines G. ............................................................................... 38

Figure 15. Les quatre sous-familles de chimiokines et leurs récepteurs. ......................................... 39

Figure 16. Les différents processus de mort cellulaire chez le neutrophile. ..................................... 48

Figure 17. Sécrétion de cytokines et fonctions effectrices des lymphocytes polarisés .................... 54

Figure 18. Étapes de la cicatrisation normale et pathologique de l"épithélium. .............................. 62

Figure 19. Processus du remodelage tissulaire ................................................................................. 63

Figure 20. Relations complexes entre les différentes maladies inflammatoires chroniques des

voies respiratoires .................................................................................................................... 64

Figure 21. Le paradigme Th2 associé aux maladies atopiques. ........................................................ 67

Figure 22. Phénotype inflammatoire dans l"expectoration chez des patients atteints d"asthme

stable. ....................................................................................................................................... 71

Figure 23. Métabolisme de la L-arginine. .......................................................................................... 77

Figure 24. Images représentatives d"une coupe histologique des bronchioles (A) et d"une

cytologie du LBA (B) chez un cheval atteint du souffle en crise. .............................................. 87

Figure 25. Expression de cytokines de type Th2 associée à l"obstruction respiratoire et à la

neutrophilie pulmonaire chez les chevaux atteints du souffle................................................. 90

Article #1

xiii

Figure 1. Study time line........................................................................................................................125

Figure 2. Gene expression in neutrophils from control and heaves-affected horses after

stimulation with microbial products...................................................................................................126

Figure 3. Gene expression in mononuclear cells from control and heaves-affected horses after

stimulation with microbial products....................................................................................................127

Figure 4. Correlations between TLR4 and pro-inflammatory cytokines mRNA expression in

neutrophils and mononuclear cells......................................................................................................128

Figure 6. The enhanced survival of peripheral blood neutrophils (PBN) from asymptomatic heaves-affected horses cultured with microbial products is strongly associated with their

during clinical remission.........................................................................................................................130

Article #2

horses (n = 6) during antigen challenge...............................................................................................149

Article #3

Figure. 1. IL-4 induces morphologic changes in equine neutrophils.................................................179

Figure 2. IL-4 induces concentration and time-dependent expression of IL-8 mRNA in equine Figure 3. IL-4 induces the release of CXC chemokines receptor (CXCR)-2-ligands by equine

neutrophils in culture supernatants......................................................................................................180

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