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Thèse soutenue le 16 décembre 2005 par

Anne-Cécile PETIT

Ingénieur ENSCR

MODIFICATION D'UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR MODIFICATION D'UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR

UNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDSUNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDS

Thèse réalisée sous la direction des Docteurs:

Nicolas NOIRET

Laboratoire Synthèses et Activations de Biomolécules

Sylvia COLLIEC-JOUAULT

Laboratoire Biotechnologies et Molécules Marines

Introduction

Techniques d'analyses

Dépolymérisation par les ultrasons

Dépolymérisation par catalyse métallique

Evaluation d'activités biologiques

Modifications chimiques de

l'EPS

Conclusion

Plan de l'exposé

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Techniques d'analyses

Dépolymérisation par les ultrasons

Dépolymérisation par catalyse métallique

Evaluation d'activités biologiques

Modifications chimiques de

l'EPS

Conclusion

Plan de l'exposé

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Introduction

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

L'environnement hydrothermal

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Les exopolysaccharides

Criblage parmi

les isolats

Production

d'EPS Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005 - Diversité des structures chimiques - Relative facilité de récupération des polysaccharides exocellulaires - Conditions contrôlées de leur biosynthèse - Biosynthèse en fermenteur - Propriétés de suspension, d'épaississement, de viscoélasticité - Formation de gels Intérêts industriels des exopolysaccharides (EPS)

Manipulation de microorganismes

Métabolites secondaires formés pendant la fermentation

Haute viscosité en solution

Modifications

•Souche bactérienne: Sous-espèce d'Alteromonas macleodiisubsp. fijiensis biovar deepsane •EPS de masse molaire élevée: M >10 6 g/mol

Composition:

40-50% d'oses neutres (Glu, Gal, Rha, Fuc, Man)

30-40% acides uroniques (GlcUA, GalUA)

•Hypothèse de structure: Undécasaccharide avec 3 ramifications et la présence d'un acide glucuronique substitué en position 3 par un lactate

L'EPS HYD 657

Objectifs de la thèse:

élargissement du champ d'application de l'HYD

657
Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005 3.10 6 g/mol pour le lot de thèse

Brevet EP 0987010A2, Lanatech

L'HYD 657 commercialisé sous le nom " Abyssine

» possède

des propriétés apaisantes en application topique cutanée

Analyses chimiques

• Analyses qualitatives et quantitatives des résidus osidiques

Chromatographie gazeuse

Dosage des acides

uroniques

Dosage des oses par la

méthode Orcinol

Colorimétrie

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

• Dosage des métaux par spectrophotométrie de flamme• HPSEC (High pressure steric exclusion chromatography)

Détermination des masses molaires

moyennes (M w, M n , M p ) et de l'indice de polydispersité • Mesure de la viscosité par un viscosimètre rotatif chimiques enzymatiques •Radiations gamma •Faisceau d'électrons •Irradiation UV •Micro-ondes •Irradiation ultrasonique

Selon la littérature:

•Bons rendements • Pas d'altération de la structure chimique • Peut être stoppée à tout instant • Pas de formation de produits secondaires • Distribution de masses relativement étroite

Différentes voies de dépolymérisation

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005 physiques enzymatiques chimiques

Introduction

Techniques d'analyses

Dépolymérisation par catalyse métallique

Evaluation d'activités biologiques

Modifications chimiques de

l'EPS

Conclusion

Plan de l'exposé

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Dépolymérisation par les ultrasons

Origine physique de la sonochimie

Dépolymérisation par irradiation ultrasonique Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Sonificateur basse fréquence (20 kHz)

Microsonde conique ultra haute intensité

(~100W) pour des volumes traités de 1-10 ml.

Sonde conique haute intensité (~300W) pour

des volumes traités de 10-250 ml.

Microprocesseur

Cryostat

Les ultrasons au laboratoire

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Liquide de

refroidissement

Possibilité d'une

circulation en continu de la solution d'EPS Ajout

Viscosité du solvant

Température

Volume de la solution

Fréquence d'irradiation

Concentration en EPS

Détermination des facteurs influents

Pulse

Durée d'exposition

Dépolymérisation par irradiation ultrasonique Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Cinétique de dépolymérisation

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Cinétique pour 10 ml d'EPS ( 2,5 g/L)

à 60°C

050010001500200025003000

060120 180 240

Durée d'exposition aux ultrasons (min)

Mw (kg/mol)

Durée d'exposition

M w ~200 000 g/mol I p ~2

Composition

chimique inchangée

Viscosité proche de

l'eau

1,71,8% Man1212,3% Glc22,221,7% Gal7,57,3% GalA5,56,1% GlcA1,91,8% Fuc3,23,4% RhaAprès 10 h

d'exposition aux ultrasonsNatifEPS

Importance de la concentration

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Concentration en EPS

100000150000200000250000300000

1,52 2,53 3,54 4,5

[C]=3g/l[C]=2g/l M w (g/mol)

Durée d'exposition aux ultrasons (h)

Cinétique pour 10 ml d'EPS à 60°C

Moins bonne

efficacité :

Plus de liaisons à

cliver

Viscosité plus

importante

Importance de la viscosité

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Viscosité du solvant

0100200300400500600700800900

12345
1 2 Évolution de la viscosité en fonction de la [C] pour T 1 = 30°C et T 2 = 60°C

Viscosité (mPas)

Concentration (g/L)

Moins bonne efficacité:

de la viscosité avec la [C]

Cavitation plus difficile

à obtenir

Température

importante

Pas d'amélioration

proportionnelle à la quantité d'H 2 O 2

Combinaison H

2 O 2 /US améliore l'efficacité

2,1214 680112 140239 140

3h ultrasons

3,3118 16043 530145 650

3h ultrasons,

0,48% H

2 O 2

2,991 86041 220118 770

3h ultrasons,

0,24% H

2 O 2

3,952 355 590762 1503 010 020

HYD 657 natifI

p M p (g/mol) M n (g/mol)M w (g/mol)EPS H 2 O 2 +))))2 OH

Influence de l'ajout de H

2 O 2 Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005 Ajout

400 mg d'une solution à 2g/L soumise à 3h d 'exposition aux ultrasons à 60°C:

Pas de modifications de

la composition osidique

Pas d'amélioration à

température ambiante

Barrière technique:

puissance des transducteurs

Transmission d'énergie

Viscosité du produit

Échauffement de

l'échantillon

Les Ultrasons dans l'industrie

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Semi-Batch

LEPMI UMR 5631 GRENOBLE FRANCE

Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-chimie

des Matériaux et des Interfaces Montage retenu pour le premier changement d'échelle

Réacteur à

double enveloppe

Réacteur

Sonochimique Générateur

Pompe Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Possibilité

d'enrichir le milieu en EPS

Possibilité de

contrôler la température

Possibilité de

régler le débit La reproductibilité à plus grande échelle doit être vérif iée D'autres modes de fonctionnements pourraient être envisagés

Passage à un petit pilote

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005 Essai réalisé avec un dispositif BF en mode pseudo batch (sans optimisation) dissous dans 9 litre soumis à 15h d'ultrasons

200 000250 000300 000350 000400 000450 000500 000

3691215

M p (kg/mol)

Durée d'exposition aux ultrasons (h)

Cinétique de dépolymérisation

du petit pilote en BFEPS NatifAprès 15 h d'exposition aux ultrasons % Rha 3,4 3,1 % Fuc 1,8 1,8 % GlcA 6,1 5,3 % GalA 7,3 7,7 % Gal 21,7 24,5 % Glc 12,3 12,8 % Man 1,8 1,8 M w < 300 000 g/mol I p ~2,5

Composition

inchangée

Faisabilité vérifiée

• Détermination des facteurs les plus influents Bilan de la dépolymérisation par les ultrasons

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Concentration en EPS

Pulse

Température

Viscosité du solvant

Volume de la solution

Ajout

Fréquence d'irradiation

Durée d'exposition

- Durée d'exposition aux ultrasons - Concentration en EPS - Volume - Ajout (H 2 O 2 ,métal)

Facteurs les plus influents

• Bonne reproductibilité (Ecart type < 10 000) • Rendement élevé (> 95%) • Sans altération de la composition chimique • Stabilité dans le temps • Échantillons variés obtenus (20mg 18g) chimiques

Différentes voies de dépolymérisation

physiques enzymatiques

Par hydrolyse acide

Dépolymérisation destructrice, mauvais rendements obtenus

Par ajout d'acide nitreux

Nécessite la présence de groupements a

m inés

Par ozonolyse

Réactions secondaires

Par oxydation par le periodate

Possibilité de former des formaldéhydes

Par électrolyse

Par catalyse métallique

So utenance de T h

èse-

Anne-Cécile PETI

T 1

6 décembre 2005

Introduction

Techniques d'analyses

Dépolymérisation par les ultrasons

Evaluation d'activités biologiques

Modifications chimiques de

l'EPS

Conclusion

Plan de l'exposé

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Dépolymérisation par catalyse métallique

Dépolymérisation par catalyse métallique

Brevet Ifremer n°WO9708206

Concerne la dépolymérisation de fucanes

- Obtention de faibles poids moléculaires de composition constante - Elimination possible du métal par l'utilisation d'une résine Chélex - Ultrafiltration utilisée pour purifier les fractions dépolymérisées Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

Conditions douces

Bon rendement

Peut être stoppée à tout instant

Réduction par NaBH

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