[PDF] Optimisation dun protocole dextraction et de purification dADN de

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lJNIVERSITECHEIKHANTADIOPDAKAR }<'ACULTEDESSCIENCES

ETTECHNIQUES

DEPARTEMENTDE

BIOLOGIEVEGETALE

Mémoirepourl'obtentiondu

DIPLOMED'ETUDESAPPROFONDIES

Présentépar

MoudjahidDEMBADIALLO

OPTIMISATIOND'UNPROTOCOLED'EXTRACTIONETDE PlTRIFICATION.D'ADNDE NODlTLESDE

LEGUMINEUSES

soutenu le 16Juin1999 devantlaCommissiond'Examencomposéede :

Président:M. AmadouTidiane

Membres:M. Nicolas

M.lbrahima

M. Robin

M. Marc

BA

DIALLO

NDOYE

DUPONNOIS

NEYRA

Professeur,UCAD

Maître deConférences,UCAD

Maître deConférences,UCAD

Chargé deRecherche,IRD

Chargé deRecherche,IRD

légumineuses. 1 1 1 1

Nom:DEMBADIALLOPrénom:Moudjahid

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 de diversmodes have ofbothessentialcompounds perfectlyamplifiable.Thisprotocolewassuccessfully testedwithdifferentstypesofnodules,from experimentalconditions.Application ofthistechniqueforcompetitionstudies betweenstrainsis discussed. AcNa ADN ARNr BET CIRAD CTAB dNTP DO EDTA IRD ISRA min mL ng

ORSTOM

pb PCR pH pvpp QSP RAPD RFLP rpm T

ABREVIATIONS

:acétatedesodium :AcideDesoxyribo-Nucleique :AcideRibo-Nucleiqueribosomal :Bromured'Ethidium le développement :CetylTriméthylArnmoniumBromide :désoxyribonucléotidetri-phosphate :densitéoptique :Ethylènediaminetetra-Acetate :InstitutSénégalaisde RecherchesAgricoles :minute :millilitre :nanogramme leDéveloppementen

Coopération

:pairedebase :RéactiondePolyméraseenchaine :Potentielhydrogène :PolyVynilPolypyrrolidone :quantitésuffisantepour d'ADN :Rotationparminute :température

Taqpolymérase

TBE UCAD

UV/VIS

v/v w/v YL YLA YM YMA )lI

HaeIII

MspI :TrisBorateEDTA :UniversitéCheikhAntaDiopdeDakar :Ultra-VioletlVisible :volume/volume :poids/volume :YeastLactate :YeastLactateAgar :YeastMannitol :YeastMannitol Agar :degrécelsius : rnicrolitre :Enzymederestrictionpurifiéede

Haemophilusaegyptius

Ala.}l1bl1oizedetousceuxquiHIesontche'ls

A26erzet2ste'l

1tom6'lt'uxpou'Z

touslescite'Z.

Scie1tcesdel''Z{CA'l'j,etplus

l'ho1t1teu'Zdep'Zéside'Zceju'Z"{. 'Zéa.lisa.tio1tdecet'Z4IJtlil. spohtahemmehtdejUtie'lcet'laivail. '}'exp'lime 'g-acultédes p'latiques. '}'exp'lime p'lécieuSeet

Sohamitié.

'}e icitexp'lCssiOh demaslfmpathie. t'laM.il.

SOMMAIRE

1.INTRODUCTION1

2.

RAPPELSBIBLIOGRAPHIQUES.4

2.4.

3.MATERIELSETMETHODES11

3.1.Originedesnodules11

3.8.Amplificationenzymatiquedel'ADN16

3.8.1.Amorcesutilisées16

3.8.2.AmplificationdeL'IG5165/23516

3.8.2.1.Conditionsdelaréaction16

3.9.RFLPsurlesfragmentsamplifiés17

4.RESULTATS18

d'ADNdenodule20

4.4.Amplificationenzymatiquede]'ADN21

4.5.Choixdesenzymesderestriction21

5.DISCUSSIONSETCONCLUSIONS23

6.

REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES28

ANNEXE35

1.INTRODUCTION

Introdllction

1.Introduction

légumineusesetlaproduction lenouvelenvironnement.Ile'>t lespluspropices environnementaux,parlaplantehôte,par répartitiondanslesol.Acescontraintes, responsabledudéclindes biotiquespeuventréduire antibiotiquesproduitspar bien

àuneétudeau

surlessouchesinoculéeset biodiversité.Danslesdeuxcas de ouparsélectiondemutants resistants d'immunofluorescenceou illtroduetlOl1 dugèneutilisé,maispascelle et

Frankia(Rouvieretal.,1996;Navarroetaf..

(i)laPCRnécessitetrèspeu pourobjectif d'unprotocoled'extractionetde purification actinorhiziennesappartenant A.albidaA.seyal,A.lIlangiulIl,A. 2

IntroductlVn

nouspermettra inoculées. 3

2.RAPPELSBIBLIOGRAPHIQUES

Rappelsbibliographiques

2.Rappelsbibliographiques

sontensymbioseavecles unfaibleniveaudefixation symbiotiqued'azotedue etal.,1988,Beek,1992).

Pourremédier

de environnementaux(Thies toujoursdans survivreet

àcoloniserlesoldelarhizosphère.

priori (Bottornley,1992).Cettediversitéest pu poursuite 4

Rappelsbibliographiques

consideréeetnonàl'ensembledes de sélectifspermettantl'enrichissementen trouvésdans lataille,lanature

Rhizobiumdanslesol(Amarger,1996).

Rhizobiumspécifiquesdela

lesojaenEurope,oulorsqueles les populationindigènede del'inoculation(Hametal.,1971).L'absence absencedans

àcettesouchedese

retrouvermultipliéepar 10 2- 10 3 augmentationestsouventtransitoireet

àunniveauvoisinde

celuidessouches indigènessansqu'ilsoitpourcelanécessairequelasoucheformedesnodules ni dans 5

Rappelsbibliusraphiqlles

(Arnarger absolue sol.Leséchecsd'inoculationnepeuventpasêtreconsideréscomme systématiquementcauséspar nodulation. nativesesttrèsefficace(Brill,1981). natives ily aparfoisabsenced'améliorationdurendement.Eneffet,lessouchesintroduites

Plusieursméthodes

l'occupation d'azoteet préférabledepouvoiridentifierdirectementlasouche présentedanslesnodositésetplusieurs approches ontétédécritesdanscesens. examinées. 6

Rappelsbibliographiques

utilisées. petitestailleset nonspécifiques.Elles vontdecefaitsefixerendenombreuxsitesdel'AD?\: travaillerquesur etal.,1978;Goullet,1980:

D'unemanière

générale,l'étude protéiqueapartir enzymatiqueparrapport réactioncolorée.

àtousleslocisenzymatiques

examinés(Young,1992). etal.,1988:

Assay)

nenécessitepas dessouches(Kishinevsky

peutêtreutiliséavecdesbactériesnonisolées(systèmesracinaires,sols,...) àconditiondedisposer

d'anticorpsspécifiques (Fernandez-FlouretetCleyet-Marel,1987). 7

Rappelsbibliographiques

hétérogène. quipermettentdeciblerunbiomarqueur

L'utilisationd'amorces

l'augmentationdusignal. obtenuausein prendreenconsidérationlesbiaisliés recombinantesouchimères decycles),l'utilisation

PCRparlaformationde

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