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AVERTISSEMENT

Ce document

est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l'utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale.

Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine.fr

LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 JURY:

INSTITUT NATIONAL DE LORRAINE

Ecole Nationale Supérieure d'Agronomie et des Industries Alimentaires

Laboratoire des Sciences

du Génie Chimique THESE présentée en vue d'obtenir le diplôme de DOCTORAT DE L'INSTITUT NATIONAL POL YlECHNIQUE DE LORRAINE par

Chantal CA YUELA

Ingénieur ENSAIA

CINETIQUE ET MODELISATION

DE LA PRODUCTION DE PENICILLINE ACYLASE

PAR

Escherichia coli RECOMBINEE

Soutenue publiquement le 6 Novembre 1990 devant la Commission dExamen

Président :

Rapporteurs:

Examinateurs :

M. J-M. ENGASSER

MIlle C. BRANLANT

M. J-L. SIMON

MM. J. BOUDRANT

J-B. GROS

de la Documentation INPL

Nancy-Brabois

A ma mère,

A ma famille ...

J'ai conjuré le sort

J'ai recherché l'oubli

J'ai refusé la mort J'ai rejeté l'ennui

Et j'ai fermé les poings Pour m'ordonner

de croire

Que la vie était belle

Fascinant le hasard ...

Barbara (Soleil Noir)

AVANT-PROPOS

Je tiens à remercier Monsieur Daniel Tondeur, directeur du Laboratoire des Sciences du Génie Chimique de Nancy, de m'avoir accueillie dans son laboratoire. Ce travail a été réalisé dans le groupe GPBA sous la direction de Monsieur Jean-Marc

Engasser, Professeur

à l'EN.SAl.A. (Nancy). Je tiens à lui exprimer toute ma gratitude pour l'intérêt qu'il a toujours poné à ce travail ainsi que pour ses judicieux conseils. Je tiens également à remercier Madame Christiane Branlant, Directeur de Recherche

(CNRS) au Laboratoire d'Enzymologie et de Génie Génétique (Université Nancy 1), pour la qualité

de son accueil et sa précieuse collaboration. Je remercie Monsieur Joseph Boudrant, Directeur de Recherche (CNRS) au LSGC pour toute l'aide et les conseils éclairés qu'il m'a apportés. Je remercie Messieurs Jean-Luc Simon, Ingénieur dans le Département Biotechnologie (Rhône-Poulenc), et Jean-Bernard Gros, Professeur

à l'Université Blaise Pascal

(Clermont-Ferrand), d'avoir accepté de juger ce travail et de participer à ce jury de thèse.

Un travail de recherche étant avant tout unformidable travail d'équipe, je tiens à présenter

et

à remercier:

A la technique: Mme Dominique Storck, Marie-Thérèse, Evelyne, Bernard.

A lafaculté

des sciences: Nathalie, Hassane, Sylvie, Jean-Paul, Evelyne, Jacqueline, Annie.

Au thé quotidien: Jocelyne, Louise,

Anne, Mohamed, Aung, Freire, Michel, Bruno.

Au soutien moral: Catherine, Isabelle, Christophe, Laila, Caroline, Rona. Au soutien des thésards: Nassim, Emmanuel, Dominique. Et au piano: Stéphane. "merci de vous"

SOMMAIRE GENERAL

INTRODUCTION 1

PARTIE A: REVUE BffiLIOGRAPHIQUE P 6

I -Microorganismes recombinés : utilisation et construction p 8 n -Présentation de la pénicilline acylase p 29

In -Aspect microbiologique p 42

IV -Modélisation p 54

PARTIE B : MATERIEL ET :METIIODES 73

1 Présentation de la souche et du vecteur p 76

n -Réactifs p 78 nI -Stérilisation p 79

IV -Appareils p 80

-Conduite des fermentations p 82 VI -Méthodes d'analyse p 86 VII -Exploitation des données expérimentales p 98 PARTIE C : ETUDES PRELIMINAIRES DES CONDmONS DE CULTURE POUR LA PRODUCTION DE PENICILLINE ACYLASE ET COMPARAISON DE LA

SOUCHE ET DE LA SOUCHE RECOMBINEE P 101

I -Mise au point des conditions de culture pour la production de pénicilline acylase p 104 II -Comparaison de la souche hôte et de la souche recombinée p 128 PARTIE D : ETUDE DES CINETIQUES ET DES PERFORMANCES DES

CULTURES EN REACTEURS DISCONTINU, SEMI-CONTINU

ET CONTINU P 138

1 -Etude des cinétiques et des performances en culture discontinue p 145 II -Etude des cinétiques et des performances en culture semi-continue p 179 III -Etude nes et des en p 200 IV -Comparaison des cinétiques c;;t des perfOnIl<.illces la souche G271 dans les trois modes de culture p 218

PARTIE E : MODELISATION p225

I -Elaboration du modèle p 229 II -Identification des paramètres du modèle p 244 III -Application du modèle: optimisation des conditions d'alimentation pour une fermentation semi-continue p 299

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 312

ABREVIATIONS

P 317

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

P 2

INTRODUCTION

Les cellules vivantes sont des réacteurs chimiques d'une grande complexité: une cellule contient

plus de mille protéines différentes, participant aux réactions intracellulaires.

La physiologie d'une

cellule est déterminée par son matériel génétique (ADN), et une modification de l'ADN altère les

capacités métaboliques de la cellule. Les mutations (modifications de l'ADN) sont provoquées

aléatoirement lorsque la cellule est soumise à un environnement "stressant". Les mutants qui ont

une spécificité métabolique plus importante sont très employés pour les fermentations

industrielles. Durant ces quinze dernières années, la manipulation de l'ADN au niveau moléculaire

a progressé (réarrangement de séquence d'ADN) permettant d'utiliser la technologie de l'ADN recombiné. Cette technologie est utilisée pour produire en grande quantité des protéines recombinantes synthétisées naturellement ou non par l'organisme hôte. Il existe actuellement sur le marché quelques produits issus de cette technologie (insuline, hormone de croissance, vaccin ... ). L'utilisation de cette technologie se heurte à de nombreux problèmes législatifs. Pour construire un microorganisme recombiné il faut choisir un hôte et un vecteur. Le vecteur doit permettre de surproduire la protéine hétérologue.

Le vecteur est choisi en fonction du

promoteur transcriptionel, de son nombre d'exemplaires et de sa stabilité dans la cellule. Un

système hôte idéal doit exprimer correctement le gène cloné, réaliser les modifications

post-traductionnelles éventuellement nécessaires, être peu exigeant en éléments nutritifs

et se développer rapidement. Trois systèmes sont actuellement utilisés: la bactérie

Escherichia coli, la

levure Saccharomyces cerevisiae et les cellules de mammifères. Le choix du système hôte est guidé par les caractéristiques de la protéine hétérologue. Les principaux inconvénients de la technologie de l'ADN recombiné sont d'une part l'instabilité du vecteur et d'autre part la qualité parfois imparfaite de la protéine produite. Les problèmes rencontrés sont actuellement résolus au cas par cas. Une connaissance plus approfondie

du comportement des microorganismes recombinés permettra de dégager une stratégie générale

pour l'exploitation de cette technologie.

La modélisation des cultures est un outil très employé permettant entre autres de structurer

les connaissances acquises sur le comportement d'un microorganisme.

De plus, les modèles

mathématiques sont aussi employés pour le contrôle et l'optimisation des procédés fermentaires. Il 3

existe dans la littérature de nombreux modèles applicables aux microorganismes recombinés. La

production de protéines recombinantes est toujours réalisée sur des milieux complexes, et dans ces

conditions, le comportement des microorganismes est mal connu. Les modèles sont élaborés en simplifiant les conditions de culture, un milieu complexe est généralement assimilé à un milieu synthétique. Il est donc intéressant d'essayer de construire un modèle applicable aux cultures sur milieux complexes. L'élaboration d'un modèle mathématique se décompose en plusieurs étapes.

La première

consiste à établir les lois cinétiques à partir des phénomènes clefs déterminant

la croissance, la production d'un métabolite et la consommation des substrats. De nombreux paramètres cinétiques

sont employés dans les expressions mathématiques des lois cinétiques, aussi l'identification des

paramètres constitue la deuxième étape. Enfin, le modèle est validé en comparant les cinétiques simulées et expérimentales. L'étape d'identification des paramètres bien que très importante ne

s'appuie généralement pas sur une méthodologie bien définie. Les autres étapes ont, elles, été

systématisées, ce qui a permis d'élaborer des logiciels d'aide à la modélisation. Le travail que nous avons effectué s'inscrit dans cette optique et le système hôte vecteur utilisé est une souche d'E. coli recombinée produisant de la pénicilline acylase (PA). Cette enzyme

est industriellement utilisée pour la production d'acide 6-aminopénicillanique. Ce composé est un

intermédiaire clef utilisé dans la synthèse d'antibiotiques semi-synthétiques dont l'utilisation est en plein essor. La pénicilline acylase est une enzyme d'un grand intérêt industriel justifiant pour sa production la mise en oeuvre de microorganismes recombinés.

Les objectifs de notre travail sont multiples.

Nous étudierons les interactions entre la cellule hôte et le vecteur. Nous analyserons le comportement du microorganisme recombiné cultivé sur milieu complexe. Nous emploierons 3 différents modes de culture: discontinu, semi-continu ec

continu, de manière à déterminer les phénomènes clefs qui nous permettront de définir les lois de

croissance, de production de la PA et de consommation des substrats. Nous établirons ensuite un modèle applicable à la culture sur milieu complexe d'un microorganisme recombiné. Au cours de cette étude, nous développerons une méthodologie pour identifier les paramètres cinétiques du modèle. La première partie de notre travail sera consacrée tout d'abord au choix des conditions de cultures favorables à la production de PA, lesquelles seront conservées pour la suite de l'étude. Puis, nous étudierons l'influence du plasmide sur le comportement de la souche hôte. 4 La deuxième partie sera consacrée à l'étude cinétique de la souche en fermentations discontinue, semi-continue et continue. Nous comparerons d'une part les performances de la souche en fonction du mode de culture et d'autre part, nous analyserons le comportement de la souche sur un milieu complexe. Dans la dernière partie, nous proposerons un modèle applicable

à la fermentation, en milieu

complexe, de la souche E. coli recombinée pour la production de PA. Dans cette partie, nous

développerons une méthode visant à rationaliser l'estimation des paramètres du modèle.

PARTIE A

ETUDE 6

PARTIE A : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1 • Microorganismes recombinés : utilisation et construction p 8

1.1. HistoriQue et as.pect industriel p 8

1.1.1.-Historique p 8

1.12.-Aspect industriel p 8

1.2. -Systèmes hôtes-vecteurs p 12

1.2.1. -Systèmes hôtes p 12

122. -Systèmes vecteurs p 16

12.3. -Couples hôte-vecteur p 18

1.2.3.1. -Modes d'expression p 18

1.2.3.2. Contrôle du nombre de copies de plasmides

par cellule p 21

1.2.3.3. Instabilité du vecteur p 21

1.2.3.4. Relations entre la cellule hôte et son vecteur p 24

1.3. -Conclusion p 27

II· Présentation de la pénicilline acylase p 29 II.1. -Présentation de la pénicilline acylase p 29

II.1.1. -Microorganismes producteurs p 29

II.12. -Activité enzymatique p 31

II.1.3. -Synthèse de la pénicilline acylase p 31 II.1.3.1. -Pénicilline acylase : le gène p 31 II.1.3.2. -Régulation de la synthèse de la pénicilline acylase p 33

11.2. Production de la pénicilline acylase p 36

II 2.1. -Production de la pénicilline acylase par E. coli p. 36 II.2.2. -Production de la pénicilline acylase par E. coli recombinée p 39 7

III· Aspect microbiologique p 42

111.1. -Présentation de la souche p 42

Ill.2. -Principaux Paramètres de la croissance p 42 /1l2.1. -Source de carbone et d'énergie p 42quotesdbs_dbs13.pdfusesText_19

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