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UNIVERSITÉ D'ANGERSAnnée 2010

Thèse n° 1119

ONCOGÈNE RAS ET CANCER COLORECTAL : ÉTUDE DE LA RÉPONSE AU STRESS ONCOGÉNIQUE ET DE L'ÉCHAPPEMENT À LA SÉNESCENCE

THÈSE DE DOCTORAT

SPÉCIALITÉ : BIOLOGIE CELLULAIRE

ÉCOLE DOCTORALE BIOLOGIE SANTÉ NANTES ANGERS

Présentée et soutenue publiquement

le 15 novembre 2010

à Angers

par Sophie de Carné Trécesson

Devant le jury ci-dessous :

Brigitte Sola, rapporteur, Directrice de Recherche CNRS, Caen Corinne Abbadie, rapporteur, Professeur des Universités, Lille Erick Gamelin, examinateur, Professeur des Universités, Angers Philippe Juin, examinateur, Directeur de Recherche INSERM, Nantes Olivier Coqueret, directeur de thèse, Professeur des Universités, Angers

Directeur de thèse : Pr Olivier Coqueret

INSERM U892

Centre de Lutte Contre le Cancer Paul Papin

2 rue Moll

49933 Angers cedex 09

ED 502 - BS

REMERCIEMENTS

Pour commencer, je tiens à remercier les Professeurs Erick Gamelin et Olivier Coqueret de m'avoir accueillie au sein de leur laboratoire, et particulièrement le Professeur Olivier Coqueret de m'avoir permis de réaliser cette étude. Je remercie également le Professeur François Régis Bataille, actuel directeur du Centre

Paul Papin où j'ai pu réaliser ces travaux.

Je tiens à remercier le Professeur Corinne Abbadie ainsi que le Docteur Brigitte Sola d'avoir accepté, en tant que rapporteurs, de consacrer une partie de leur temps à examiner ce travail. Leurs conseils m'ont permis de considérablement enrichir ce manuscrit. Je les remercie également pour leurs encouragements. Merci au Professeur Erick Gamelin d'avoir accepté de siéger à ce jury et d'avoir bien voulu examiner cette thèse. Je le remercie aussi d'avoir consacré de son temps en venant

participer aux réunions de laboratoire organisées lorsqu'il était directeur du Centre Paul

Papin. Sa passion pour la recherche et l'intérêt qu'il a porté à notre travail ont, pour moi, été

très encourageants. Je remercie également le Docteur Philippe Juin d'avoir accepté de faire partie de ce jury et d'examiner cette thèse. Je lui suis reconnaissante d'avoir suivi mon travail au cours de

ces trois années de thèse. Les discussions que nous avons eues ont été très enrichissantes.

Mes plus respectueux remerciements vont à mon directeur de thèse, le Professeur Olivier Coqueret, pour m'avoir accueillie dans son équipe et pour m'avoir fait confiance. Je le

remercie de m'avoir guidée tout au long de ce travail et d'avoir été aussi disponible. Je crois

savoir que ses cours donnés à l'université d'Angers ont été le moteur de nombreuses

vocations, dont la mienne. Mes remerciements s'adressent également au Docteur Catherine Guette. Les

biologistes étant parfois de piètres chimistes, ses conseils m'ont souvent été bien utiles. Merci

à elle pour sa grande sympathie.

Un grand merci à Ben, ou devrais-je dire au Docteur Benjamin Barré, pour son

soutien et ses nombreux conseils durant cette dernière année de thèse. Merci à lui pour le

temps consacré à me guider dans la recherche de postdoc, ainsi que pour être venu pendant ses vacances, m'écouter parler anglais ! Merci également au Professeur Alain Morel et au Docteur Michèle Boisdron pour ce qu'ils m'ont apporté au cours de ces trois années de thèse. Je remercie le Docteur Agnès Chassevent ainsi que Cécile et Denise pour leur disponibilité et leur sympathie. J'adresse également des remerciements à mes copines de laboratoire, devenues bien

plus aujourd'hui. Merci à Agnès d'avoir été la première personne à m'accueillir au labo (je me

rappelle mon premier jour au CPP). Merci pour les soirées bohèmes angevines et les skypéro 1 depuis que tu as quitté Angers (prolongés tard dans la nuit maintenant que nous ne vivons plus sur le même fuseau horaire). Pressée de recommencer, à Washington DC ou ailleurs. Merci ma Chacha, d'avoir été là tout le temps pour me soutenir et m'encourager. Merci pour toutes tes choubidouseries et pour ce qui te motives à t'agiter en ce moment... Je crois savoir que tu manigances bien des choses ! Merci aussi à toute l'équipe de recherche du 4 e. Les nouvelles arrivées, Laurence et

Zaza, qui ont incontestablement égayé l'ambiance du bureau des étudiants en thèse (si tant est

qu'il eût fallu l'égayer...). Merci à toutes les deux pour leur précieuse aide à tous les niveaux.

Merci à Alice, et vive la protéomique ! Merci aux autres thésards, tous dans le même bateau,

euh... Non, bureau ! À Andreea, Sandy et Émilie, qui ont déjà presque quitté le labo. À

Anthony, cher acolyte, merci d'être venu apporter une touche de testostérone à ce labo très

féminin et d'avoir supporté mon envahissement, tant à la paillasse qu'au bureau... Merci pour

ton soutien, pour les penses-bêtes... Sans toi je ne serais toujours pas réinscrite en 2 e année

de thèse ! Merci à Hélène, et courage à elle pour la dernière année. Merci aussi pour les

soirées à la Cale cet été, joyeuses pauses pendant la rédaction de ce manuscrit.

1 Vidéoconférences améliorées

Merci aux nouveaux arrivants du bureau des thésards, Audrey qui commence déjà à vouloir mettre du NF-κB partout, et Damien, la relève en protéomique. Merci aussi à Sory, notre docteur en statistiques, avec qui j'ai souvent aimé

philosopher à des heures tardives au laboratoire, et grâce à qui j'ai appris qu'à la mode

malienne les Docksides se portaient avec un costume... Merci à mes 'relecteurs', aussi nombreux soient ils, en particulier à Zaza qui connaît maintenant pratiquement toute ma thèse ! J'aimerais saluer les participants d'une soirée dont je garde un excellent souvenir.

Émilie, Sandy, Laurent, Chacha et Audrey, j'ai été terriblement et agréablement surprise par

le grain de folie qui, une soirée de l'été 2009, vous a conduit jusqu'à cette fameuse

Chaumière à 300 km d'ici.

Merci aux anciens et à ceux de passage. Je tiens à remercier Amélie pour ses encouragements et son soutien. Je salue son parcours sans faute ! Merci également aux trois

médecins, Pierre, Paule et Steph dont le passage au laboratoire a été plus qu'enrichissant. Je

n'oublierai pas la période où vous étiez tous les quatre au laboratoire, ni les soirées passées

ensemble. Clin d'oeil à Laurent avec qui j'ai commencé au labo du CPP en Master 2. Bon

courage à toi pour la suite. Et merci à Aude-Hélène, (encore un médecin !) pour ses

explications vraiment claires et très détaillées sur l'histologie du cancer colorectal. Je pense aussi à Arnaud, Julia, Marie-Laure ainsi qu'à l'équipe de Monteclair, pour tout

ce qu'ils m'ont apportée tant au niveau scientifique que pour leur amitié. Une pensée en

particulier pour Dorothée, Isa et Simon qui, patiemment, ont supporté mes débuts à la

paillasse. Mais je songe aussi à Céline, Gersende, Émilie et Chacha (au masculin) dont la sympathie m'a été très agréable. Merci à Tom, pour la manip de dernière minute, imaginée sur un coin de table entre deux bières... Et qui marche en plus ! C'est beau la science quand ça se passe comme ça Je remercie également Yannis Guillemin. Agréable rencontre il y a quelques mois, qui a permis une jolie collaboration. Merci pour ton dynamisme contagieux. Merci également à Fabien Gautier, pour les échanges de types cellulaire et autre matériel de labo. J'adresse mes sincères remerciements aux salariés du Centre Paul Pain et notamment, aux membres de l'équipe d'oncopharmacologie. Marie-Claire, Catherine, Luc, Sabrina, Adélaïde, Julie et Vincent, merci pour votre bonne humeur et votre gentillesse au quotidien.

Je garderai un excellent souvenir de ces années passées à travailler dans un même laboratoire.

Merci pour les nombreuses parties de rigolades, les pauses-cafés très animées, les délicieux

gâteaux et tout le reste. Une petite dédicace particulière à Marie-Claire - diplomate reconnue

dans notre équipe - qui a toujours réussi à satisfaire les besoins des jeunes du 4 e ! Merci à Bruno, informaticien de génie, sans qui nous resterions totalement désemparés face aux nombreux - et presque quotidiens - bugs de cette merveilleuse machine qu'est le PC. Je le remercie aussi de m'avoir gentiment prêté main-forte pour l'impression de cette thèse. J'adresse de tendres remerciements à ma famille. Mes parents, Mimi & Olive, qui ont toujours su m'encourager. Je vous remercie sincèrement de toute l'aide que vous m'avez

apportée durant ces huit années d'études. Je remercie également mes grands-parents de

m'avoir encouragée et soutenue. Merci à mes oncles et tantes, Michu, Flo. Merci à Blandine pour toute sa gentillesse. Merci à ma ribambelle de cousines et cousins, parmi lesquels il me semble qu'il y en a un qui aimerait se retrouver à ma place dans quelques années... Merci à

ma petite soeur Anne. Ma Nanouk, je n'aurais pas cru que ces dernières années auraient été

celles qui nous rapprocheraient tant. Merci d'avoir été là, nous nous retrouverons dans

l'hémisphère sud, l'année prochaine. Merci à ma presque famille, Michèle, Richard, Céline, Erwann, Camille et Briac. Merci à mes amis Bretons : Meuh, ma grande copine chérie, et Bego, Greg, merci

pour le soutien-tchat-gmail ces dernières semaines, et Soph, merci à Flo, le bac ça date..., à

Ced et Claire, jeunes mariés, à Mère-Grand, chez qui on a fait les 400 coups, à Tom, vive la

Chaum (et le reste aussi), à Zib, Cool, Gex, puis à Vince et Gio, parce qu'après tout, j'ai envie. Merci à Romain J, pour les escales angevines sur la route du vin, à Perrine et Martin,

sans doute les plus vieux, à Antoine et Maxime, les deux font la paire, à Baptiste, vive

Photoshop, à Cake, sans qui personne ne serait arrivé à Lisboa, à Guigui, le bel Italien

métamorphosé la nuit tombée, à Charly. Merci à tous ceux rencontrés lors de mon

'deuxième' métier. Mary, Marianne, sans oublier Jaja, une belle brochette et beaucoup,

vraiment beaucoup d'excellents souvenirs. Merci à Pascal, Mimic, Greg, Gildas et à tous ces furieux de saisonniers ! Merci aussi aux Angevins : Matt, Alex, Rémi et encore Meuh parce que mieux vaut

deux fois qu'une ! Mon ordinateur déborde de photos de cette époque où nous étions

inséparables. Merci aussi à Clem, Lionel, Riton, Ben d'en face et Ben Chimie.

Merci à l'équipe des gars de médecine (et des filles aussi), pour tous les bons moments passés

ensemble. Je pense particulièrement à Romain, merci d'être là. Merci à Marlon, Wlad,

Franchi, Greg, Mat et Amélie, Solène (ma petite voisine qui a supporté Joplin, à fond, à 4 h

du matin, souvent...), Arthur, Clairon et Alexis, et puisqu'on dévie de la médecine, merci au Dublin's et à ses charmants barman/maid de nous servir de la Guinness bien fraîche en toute occasion ! Finalement, merci à toi mon Benoit d'avoir merveilleusement bien accompagné et supporté cette fin de thèse. Il n'est pas toujours facile d'attendre, merci de ta patience.

TABLE DES MATIÈRES

ABRÉVIATIONS

INTRODUCTION GÉNÉRALE

I : MODÈLE D'ÉTUDE, LE CANCER COLORECTAL_____________________________ 17 ____________________________Organisation fonctionnelle des cryptes du colon 17 _______________________________________________Les cryptes de Lieberkühn 17 La voie Wnt-β_________________________________________________-caténine 18 ___________________________Instabilités génomiques dans le cancer colorectal 19 II : MÉCANISMES GÉNÉRAUX DE LA TUMORIGENÈSE__________________________ 21 ____________________________________________Initiation de la tumorigenèse 21 _____________________________________Les oncogènes, définition et historique 22 _____________________________________________Oncogènes et cycle cellulaire 23 _________________________________________Mutation sur les proto-oncogènes 24 ________________________________________________L'instabilité génomique 25 _____________________________________Cassures de l'ADN liées à la réplication 26 _______________________________Instabilité génomique acquise lors de la mitose 29 ________________________________________Autres types de cassures de l'ADN 33 _____________________Echappement aux mécanismes suppresseurs de tumeur 36 _______________________Les gènes suppresseurs de tumeur, définition et historique 36 ________________________________________Le gène suppresseur de tumeur p53 38 _________________Mise en évidence du rôle de p53 comme suppresseur de tumeur 38 ____________________________________________________Régulation de p53 39 ___________________________________________p53 et arrêt du cycle cellulaire 40 ______________________________________________________p53 et apoptose 40 ________________________________________Le suppresseur de tumeur p21Waf1 41 ___________________________________p21Waf1 et régulation du cycle cellulaire 42 ___________________________________p21Waf1 et régulation de la transcription 43 _____________________________________p21Waf1 et modulation de l'apoptose 43 _________________________________________p21Waf1 et réparation de l'ADN 44 _______________________________Choix entre apoptose et arrêt du cycle cellulaire 46 _____________________________________________La voie de p38 MAP Kinases 46 _____________________________Implication de p38 dans l'arrêt du cycle cellulaire 47 _______________________________Mutation sur les gènes suppresseurs de tumeur 48 III : LA SÉNESCENCE CELLULAIRE________________________________________ 50 ________________________________________Signature des cellules sénescentes 50 ___________________________Réponse aux dommages de l'ADN et sénescence 51 _____________________________________La sénescence induite par l'oncogène 52 _______________________________Le phénotype sécrétoire associé à la sénescence 53 ________________________________________________Sénescence et autophagie 55 IV : L'ONCOGÈNE RAS__________________________________________________ 56 _____________________________________________La protéine Ras, généralités 56 _______________________________________Fonctionnement et activation de Ras 56 __________________________________________Les différentes isoformes de Ras 56 ________________________________________Rôle de Ras dans la tumorigenèse 57 ___________________________________Activation de la voie de Ras dans le cancer 58 ____________________Mécanismes de réponse au stress oncogénique induit par Ras 60 _______________________________Détection de l'expression oncogénique de Ras 60 ___________________________________Sénescence induite par Ras et p16Ink4a 60 ____________________________Sénescence induite par Ras et cassures de l'ADN 61 _______________________________Sénescence induite par Ras et radicaux libres 61 ______________________________Induction de la sénescence indépendante de p53 63 _______________________Échappement à la sénescence et inactivation de p21Waf1 65 V : MÉCANISMES DE LA TRANSITION ÉPITHÉLIO-MÉSENCHYMATEUSE___________ 68 ____Rôle de l'EMT dans le développement embryonnaire, mécanismes généraux 69 _________Le premier événement morphogénétique : la formation du trophectoderme 70 ___________________________________________________L'adhésion cellulaire 70 ________________________________________________La polarisation cellulaire 71 __________________________________Acquisition des fonctions de l'épithélium 71 ___________________L'EMT, une deuxième transition nécessaire au développement 72 _________________________________________Régulation moléculaire de l'EMT 72 _____________________________________Rôle de l'EMT dans la tumorigenèse 75 _____________________________________L'EMT induit le processus métastatique 75 __Implication de l'EMT dans la transformation initiale et la régulation de la sénescence 76 ______________________________Implication de la protéine Notch dans l'EMT 79 ____________________________________________________Les protéines Notch 79 _______________________________________________Historique et description 79 ___________________________________________Activation de la voie de Notch 80 ___________________________________________________Fonctions de Notch 81 _____________________________________Maintenance de l'état non différencié 81 ____________________________________________Décision du destin cellulaire 81 ______________________________________________Différenciation terminale 82 _________________________________________Fonction oncogéniques de Notch 83 __________________________L'EMT confère des propriétés de cellules souches 84 _____________________________________Cellules souches et agressivité tumorale 85 ____________________________________________Origine des cellules tumorales 86 _____Implication de p21Waf1 dans le maintien des caractéristiques de cellules souches 87 VI : BUT DU TRAVAIL___________________________________________________ 89

RÉSULTATS

I : RAS INDUIT L'ÉCHAPPEMENT À LA SÉNESCENCE___________________________ 92 La surexpression de H-RasV12 induit l'entrée en sénescence et l'arrêt du cycle ________________________________________________cellulaire dans les HT29 92 H-RasV12 induit l'expression et la stabilisation de p21Waf1 indépendamment de __________________________________________________________________p53 98 __________Induction de l'expression de p21Waf1 en réponse à l'oncogène H-RasV12 98 __________Stabilisation de p21Waf1 par la voie de réponse aux dommages de l'ADN 103 ____________________p21Waf1 régule l'expression des gènes du cycle cellulaire 107 ________________Une population cellulaire échappe à l'arrêt du cycle cellulaire 110

Rétablissement de l'expression des gènes du cycle cellulaire dans les cellules ayant échappé

___________________________________à l'arrêt du cycle cellulaire induit par Ras 112 Perte de l'expression de p21Waf1 dans les cellules ayant échappé à l'arrêt du cycle ________________________________________________cellulaire induit par Ras 112 II : RAS INDUIT L_________________________________________________'EMT 114 Les cellules ayant échappé au stress oncogénique adoptent un phénotype de ______________________________________________________cellules invasives 114 _________________________________________Instabilité génomique et invasion 114 ______________________Apparition d'un phénotype de cellules mésenchymateuses 117 ______________________________Apparition d'un phénotype de cellules souches 119 _____________________Implication de la voie Jag1/Notch3 dans l'échappement 120quotesdbs_dbs44.pdfusesText_44

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