[PDF] TP 6 : Examen microscopique des micro-organismes /Létat frais

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Université Abou Bakr Belkaid-Tlemcen

Institut des sciences techniques appliquées (ISTA)

Module : Outils analytiques de Microbiologie

Enseignant (e) : Dr CHERIF ANTAR Asma

L1/2019.20202

TP 6 : Examen microscopique des micro-organismes ͬL'Ġtat frais

Objectif :

*Utiliser le microscope optique et réaliser la mise au point ; *Observation microscopique des micro-organismes ă l'Ġtat frais.

Introduction :

organismes. Elle comprend :

I. Edžamen ă l'Ġtat frais

II. Examen après coloration

1. Définition :

1.1. Le microscope optique (photonique) :

Figure 3 : microscope optique

permettent de grossir l'image donnée par l'objectif (le grossissement est de 10).

2. Le porte-oculaires (ou tête binoculaire) permet la

vision binoculaire.

3. Le porte-objectifs (ou revolver) permet d'amener

l'objectif dans l'axe de la préparation.

4. Les objectifs sont des loupes sous forme de lentilles

convergentes. Les grandissements figurent sur les objectifs : x 10, x 40, x 100. Le grossissement total du microscope est donné grâce à la formule suivante : Gt = grandissement de l'objectif x grossissement des oculaires. Ex ͗ pour l'objectif x40, Gt = 40 x 10 = 400.

5. La potence est la partie rigide qui relie la platine aux

oculaires.

6. La platine est la partie sur laquelle est posée la

préparation : elle est évidée dans sa partie centrale afin de permettre le passage des rayons lumineux. 2

7. Le chariot (ou porte objet) permet de déplacer la préparation.

8. Le condenseur permet de concentrer les rayons de la source lumineuse sur la

préparation.

9. Le diaphragme permet de régler la quantité de lumière qui arrive sur la

préparation à observer.

10. La source lumineuse éclaire la préparation.

11. Le socle est la partie sur laquelle repose le microscope : lourd, robuste et stable.

12/13. Les vis de mise au point : Les vis de commande du chariot permettent de

déplacer la préparation. La vis de commande du condenseur permet de monter ou d'abaisser le condenseur. 12/ La vis macrométrique permet un mouvement rapide mise au point de l'image. 13/ La vis micrométrique permet un mouvement lent, précis, pour effectuer les réglages fins de la mise au point de l'image. d'obserǀation permet d'apprĠcier par le biais du microscope optique: ¾ La mobilité des bactéries et leur morphologie ; ¾ La morphologie des champignons : levures et moisissures.

1.3. La mobilité bacterienne : il existe deux types de mobilité (figure 2) :

¾ La mobilité polaire : en zigzag qui peut être mono-triche (A), lopho-triche (B) ou amphi- triche (C) ¾ La mobilité péritriche : mouvement assez fluide i.e tous les flagelles vont dans le même sens (D)

Figure 2 : mobilité bacterienne

2. Technique :

1. Etat frais des bactéries :

1.1. partir d'une culture en milieu liquide :

Déposer sur une lame propre soit le contenu d'une anse de platine ou une petite goutte ă l'aide d'une pipette Pasteur prélevé d'une culture jeune en bouillon ; Recouǀrir la goutte d'une lamelle en Ġǀitant d'enfermer des bulles d'air ; Ne pas prolonger l'obserǀation au-delà de 3 à 10 minutes ; 3 Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame et recommencer).

1.2. partir d'une culture sur milieu solide ͗

DĠposer une gouttelette de l'eau stĠrile sur la lame ; Prélever une fraction de colonie sur le milieu de culture gĠlosĠ ă l'anse de platine ;

Émulsionner très délicatement (afin de ne pas casser les flagelles) de façon à obtenir

une suspension homogène ; Recouǀrir d'une lamelle en Ġǀitant d'enfermer des bulles d'air ; Ne pas prolonger l'observation au-delà de 3 à 10 minutes ; Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame et recommencer).

1.3. L'obserǀation :

¾ Les bactéries sont considérées comme mobiles lorsque des trajets très différents sont

observés (déplacement dans toutes les directions). pas confondre avec la mobilité :

Mouvements browniens : agitation moléculaire.

Mouvement liquidien : entraînent toutes les bactéries dans le même sens et à la même vitesse et ils peuvent apparaitre lors de la pose de la lamelle. ATTENTION ! Une bactérie mobile peut apparaître immobile si les conditions de l'observation ne sont pas optimales :

¾ Les flagelles ne doivent pas être cassés par la préparation ou détruit par un

instrument trop chaud ; ¾ La bactérie doit proǀenir d'une culture jeune ;

¾ La tempĠrature de l'incubation peut aussi aǀoir de l'influence ͗ certaines bactĠries

immobiles à 37°C sont mobiles à 22°C (Yersinia, Hafnia par exemple). ¾ Il est possible de confirmer la mobilitĠ par l'ensemencement d'une gĠlose molle.

2. Observation des champignons :

scotch dans le bleu coton : Déposer quelques gouttes de bleu coton sur une lame propre ; Appliquer un ruban adhésif sur une culture de moisissure ;

Coller le ruban adhésif sur la lame ;

2.2. Les levures : elles s'observent entre lame et lamelle comme les bactéries.

¾ Les observations se font à l'objectif 40, oculaire 10 en mettant la lumière au maximum mais en fermant le diaphragme ;

¾ Aprğs obserǀation, jeter l'Ġtat frais dans un bac contenant un dĠsinfectant ă large

spectre car les bactéries sont vivante. 4 TP 7: Examen microscopique après coloration/Coloration simple

Objectifs :

Réaliser des frottis bactériens ;

Déterminer la morphologie des bacteries et leur mode de groupement après une coloration simple des frottis.

1-Introduction :

L'identification permet de mettre en Ġǀidence une ou plusieurs propriĠtĠs biochimiques d'une

bactérie. Elle repose sur la morphologie, les caractères enzymatiques et biochimiques.

1. Caractères morphologiques :

¾ Examen macroscopique des caractères culturaux

L'aspect des colonies dĠpend du milieu, de la durĠe et la tempĠrature d'incubation. Il ne pourra être

mentionner plusieurs éléments:

La taille : petite, moyenne ou grande ;

La forme : bombée, plate, ombiliquée, à centre surélevé ; L'aspect de la surface : lisse, rugueux, muqueux ; La consistance : grasse, crémeuse, sèche, muqueuse ;

Pigmentation.

¾ Examen microscopique après coloration simple : classées en :

ƒ Coloration simple (un seul colorant) : La coloration au bleu de méthylène peut apporter des

informations concernant la morphologie des germes. ƒ Coloration différentielle ou double type Gram ;

2-Matériel nécessaire :

Culture bacterienne, colorant simple (bleu de méthylène), microscope optique, lame microscopique,

anse de platine, l'eau distillĠe et l'huile ă immersion. 5

3-Mode opératoire :

1. Réalisation des frottis : les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière, puis séchés

et fixés :

1-talement sur lame de ǀerre ͗ notez la rĠfĠrence de l'Ġchantillon sur une lame propres ;

2-PrĠleǀez stĠrilement ă l'aide d'une anse de platine une goutte de culture bactĠrienne et Ġtalez un

film mince,

3-Fixation du frottis : consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame, sans altérer leur structure.

La fidžation s'effectue par la chaleur ͗

2. Coloration simple : sur le frottis fixé et refroidi :

1-Faire couler la solution de bleu de méthylène jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte.

2-Laisser agir 1 minute.

3-Rincer abondamment la lame l'eau du robinet jusqu'à élimination du colorant.

4-Sécher à l'air ou délicatement entre deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans

frotter.

5-Examiner au microscope, objectif à immersion.

4-Résultats : les bactéries sont colorées en bleu sombre. Cette coloration est intéressante pour

l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement l'étude de la morphologie des bactéries.

La morphologie bacterienne :

6 7 TP 8: Examen microscopique après coloration/Coloration différentielle

Objectifs :

Réaliser la coloration différentielle afin de classer les bactéries selon leur type de Gram

1-Introduction :

Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories selon la méthode de coloration de Gram

(appelée également coloration double ou différentielle). Cette technique a été mise au point en 1884

par le bactériologiste Danois Hans Christian Gram. La répartition des bactéries en Gram+ ou Gram-

(selon leur affinité aux solvants) est un critère systématique important pour leur classification. Elle

donner également des indications sur leurs formes et leurs mode de groupement.

2-Mode opératoire :

1- Réaliser un frottis bactérien.

2- Recouvrir le frottis de la solution de cristal violet, laisser agir 1 minute ;

3- Rincer à l'eau ;

4- Recouvrir la préparation de Lugol, Laisser agir 1 minute ;

5- Rincer à l'eau ;

6- Décolorer à l'alcool 95°, laisser agir 30 sec ;

7- Rincer à l'eau courante ;

8- Recouvrir la lame de la solution de Fuchsine, laisser agir 1 minute ;

9- Rincer abondamment à l'eau, égouttée, sécher entre deux feuilles de papier buvard très propres.

10- Obserǀation au grossissement 100 aǀec une goutte d'huile ă immersion.

3-Résultats :

A l'issue de cette coloration, on peut distinguer ͗ -Des bactéries colorées en violet foncé : elles sont dites à Gram positif ; - Des bactéries colorées en rose : elles sont dites à Gram négatif.

4-Explication :

1-Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.

2- Le Lugol permet de fixer cette coloration interne.

3- L'alcool sert à décolorer le cytoplasme des bactéries à Gram négatif : elles ont une paroi pauvre

en peptidoglycanes (donc plus fine) qui va laisser passer l'alcool (molécule hydrophile), et qui

décolorera le cytoplasme. Pour les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière

imperméable à l'alcool car elle est composée d'une couche importante de peptidoglycanes (donc

plus épaisse). Elles resteront alors de couleur violette.

4- La recoloration à la Fushine ou la contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries à Gram

négatif décolorées une teinte rose permettant leur visualisation au microscope. 8 Figure : Paroi des bactéries à Gram positif et à Gram négatifquotesdbs_dbs44.pdfusesText_44

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