[PDF] Maturation de sites métalliques de protéines par les protéines à

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Thèse

Présentée par

Jean Baptiste Artero

Pour obtenir le titre de

Docteur de l'université Joseph Fourier - Grenoble I Spécialité Biologie Structurale et Fonctionnelle (Arrêtés ministériels du 5 juillet 1984 et du 30 Mars 1992)

Caractérisations biochimiques et structurales

de la E cristalline de rat, hydrogénée et perdeutériée en vue d'une étude de diffraction des neutrons.

Thèse soutenue publiquement le 23 mars 2005

devant le jury composé de : - Mr

Peter Timmins Directeur de thèse

- Mr Sean Mc Sweeney Directeur de thèse - Mr Giuseppe Zaccai Président du jury - Mr Peter Lindley Rapporteur - Mr Yves Mechullam Rapporteur - Mr Rob Ruigrok Examinateur

Thèse préparée au sein de l'Institut Laue Langevin (ILL) et de l'installation européenne de

rayonnement synchrotron (ESRF).

Abstract

All vertebrate eye lenses are transparent and have a refractive power depending on a smooth refractive

index gradient for visible light. This is achieved by the regular arrangement of the fibre cell and by the

differential expression of lens specific proteins, the crystallins. The increasing refractive index from the cortex to

the nuclear region is associated with increasing concentration of crystallins relative to water. The nuclear region,

where the refractive index is the highest, is enriched with crystallins, a family of monomeric polypeptides

synthesised mainly during the early development, that play a major role in forming the closely packed medium.

However, the high concentration is near a critical point whereby very soluble proteins undergo a low energy

phase separation driven by the competing forces of protein-water, water-water and protein-protein interactions.

This phase separation is crucial in the opacification of lens fibre cells found in certain forms of mammalian

cataract.

A high resolution neutron diffraction study can supplement the existing X-ray data and allows us to make

detailed and thorough analysis of the solvent organisation around the crystalline molecule. This will provide a

structural base for studying the effect on protein-water, water-water and protein-protein interactions. This study

will be greatly facilitated by the use of fully deuterated protein. Substituting deuterium for hydrogen will reduce

the incoherent scattering background, strengthen the high resolution diffraction data and provide an order of

magnitude gain in signal to noise. The exchange of the hydrogen by deuterium can be achieved by soaking

protein crystals in deuterated liquor but these exchangeable hydrogens represent only 25% of total hydrogens of

the protein. The exchange of all hydrogen atoms can only be achieved by an biosynthesis using a bacterial culture in a deuterated medium (deuterated glycerol and D2 O). E crystalline from rat has been chosen as a model protein system to locate hydrogen atoms of water

molecules surrounding the protein and hydrogens involved in different stabilising interactions. Large quantities

of the hydrogenated and perdeuterated protein were expressed in grown in minimal medium and

then purified. The level of the isotope substitution on non-exchangeable sites of the protein was found to be 98%

by electrospray ionisation mass spectrometry. In the absence of known biochemical activity, the hydrogenated and deuterated E crystallins were

characterised by non denaturing gel electrophoresis, isoelectric point determination and limited proteolysis.

There are no major biochemical differences between these two forms of protein. Further characterisations by

Fourier transform infrared (FTIR) and circular dichroism (CD) spectroscopies did not show any significant

differences. The hydrogenated and deuterated proteins were crystallised in H2

O and D

2

O buffers. Crystallisation

conditions, space groups and cell parameters were found to be the same for all forms of the protein. Comparison

of these four forms of E crystallin revealed no significant structural difference between them at the atomic

resolution around 1.4Å. However, the temperature factor variation of the structures at identical resolution

(HEh 2 o H Ed2 o and DEh 2 o) depends on the isotope labelling. The structures of the deuterated protein in H 2 O or the hydrogenated one with D 2 O solvent have a lower temperature factor. The molecular model of E

crystalline has been obtained at 1.36Å and some new relevant details on the structure and water network

surrounding the protein are described in this report. Neutron diffraction data collection cannot be carried out before crystal size improvement, but most

importantly, we have shown that perdeuteration itself does not alter the structural features of the protein.

Key words

Protein perdeuteration

E crystallin

Neutron and X-ray diffraction

Physicochemical properties

X-ray structure

Résumé

Tous les cristallins des vertébrés sont transparents et ont un pouvoir de réfraction. Ceci est dû à

l'arrangement régulier de cellules et à l'expression différentielle de protéines spécifiques, les cristallines.

L'indice de réfraction croissant du cortex vers la région nucléaire est associé à l'augmentation de la concentration

en cristallines. La région nucléaire, où l'indice de réfraction est le plus haut, est enrichie en -cristallines, une

famille de polypeptides monomériques synthétisés principalement pendant le développement précoce, qui jouent

un rôle important en formant un ensemble de protéines très dense. Cependant, cette concentration élevée est près

d'un point critique où les protéines très solubles subissent une séparation de phase, conduite par une concurrence

de forces d'interactions protéine-eau, eau-eau et protéine-protéine. Cette séparation de phase est cruciale dans

l'opacification des cellules du cristallin trouvée dans certaines formes de cataracte mammifère.

Une étude de diffraction de neutrons à haute résolution peut compléter les données existantes aux

rayons X et peut nous permettre de faire une analyse détaillée et complète de l'organisation du solvant autour de

la cristalline. Ceci fournira une base structurale pour étudier les interactions protéine-solvant, solvant-solvant et

protéine-protéine. Cette étude peut être considérablement facilitée par l'utilisation de la protéine entièrement

deutériée. La substitution du deutérium à l'hydrogène réduit le bruit de fond incohérent causé par les hydrogènes,

renforçant alors le rapport signal sur bruit. L'échange de l'hydrogène par le deutérium peut être fait en trempant

le cristal de protéine dans une solution deutériée mais seulement 25% de hydrogènes totaux de la protéine sont

alors échangés. Un échange total peut être uniquement effectué par une biosynthèse protéique in vivo, en

utilisant une culture bactérienne dans un milieu deuterié.

La E cristalline de rat a été choisie comme un système modèle pour localiser les atomes d'hydrogène

des molécules d'eau entourant la protéine et ceux impliqués dans des intéractions stabilisantes. De grandes

quantités de protéines hydrogénées et perdeutériées ont été exprimées dans Escherichia coli, qui a poussé dans

un milieu minimal, et elles ont ensuite été purifiées. Par spectrométrie de masse, le niveau de substitution

isotopique des hydrogènes non échangeables dans la protéine s'est avéré être de 98%.

En l'absence d'activité biochimique connue, les E cristallines hydrogénées et deutériées ont été

caractérisées par gel natif, par détermination du point isoélectrique et par des protéolyses limitées. Il n'y a aucune

différence biochimique évidente entre ces formes de la protéine. D'autres caractérisations, par spectroscopie

infrarouge et en dichroïsme circulaire, ont été employées pour étudier des différences significatives, mais aucune

n'a été décelée.

Les protéines hydrogénées et deutériées ont été cristallisées dans des tampons hydrogénés et

deutériés. Les conditions de cristallisation, les groupes de l'espace et les paramètres de maille se sont avérés être

les mêmes pour toutes les formes de la protéine. La comparaison de ces quatre formes de E cristalline n'a

indiqué aucune différence structurale évidente entre elles à une résolution atomique aux alentours de 1,4Å.

Cependant, la variation de facteur d'agitation thermique des structures à une résolution identique (HEh2

o, HEd 2 o et DEh 2 o) dépend du marquage d'isotopique. Les structures de la protéine deutériée en H2

O ou celle

hydrogénée avec un tampon D 2 O ont un facteur d'agitation thermique plus bas. Par la suite, le modèle

moléculaire de la E cristalline a été obtenu à 1,36Å et quelques nouveaux détails étonnants de la protéine et du

réseau de molécule d'eau entourant la protéine sont décrits dans ce rapport.

Jusqu'à l'amélioration de la taille des cristaux, toute collecte de données par diffraction de neutrons ne

peut pas être envisagée, mais d'une manière globale, nous avons prouvé que la perdeutériation n'induisait pas de

changement structural de la protéine.

Mots clés

Perdeutériation de protéine

E cristalline

Diffraction de neutron et de rayon X

Propriétés physico-chimiques

Structure de rayon X.

Remerciements

Mon passage à l'ILL et à l'ESRF a été une expérience très enrichissante et beaucoup

de personnes ont contribué que ce soit de près ou de loin, aux travaux décrits ici, ainsi qu'à la

composition de cette thèse. Il m'est impossible de toutes les mentionner personnellement sans en oublier ; c'est pourquoi j'espère que ces personnes ne m'en voudront pas pour cet oubli involontaire. Tout d'abord, je souhaite remercier mes deux superviseurs, Peter Timmins et Sean Mc Sweeney, qui m'ont donné ma chance avec ce projet. Je suis extrêmement reconnaissant

pour tout le temps qu'ils ont passé à essayer de m'apprendre la cristallographie que ce soit des

rayons X ou des neutrons, pour leur enthousiasme constant sur ce sujet, pour les réponses à mes questions (peut être pas assez nombreuses), et surtout pour leur patience. Ensuite je tiens à remercier Michael Haertlein qui a directement participé à ce projet et surtout pour toutes nos nombreuses discussions qui m'ont éclairé au cours de cette thèse. Je remercie les membres du jury, Peter Lindley, Yves Mechullam, Giuseppe Zaccai et Rob Ruigrok d'avoir accepté de faire partie du jury, et tout particulièrement Peter Lindley et Yves Mechullam d'avoir accepté d'être rapporteurs de ce travail. Pendant ces trois années de thèse (voire un peu plus), j'ai eu l'occasion de collaborer avec David Lemaire, avec qui, c'était toujours un véritable plaisir d'effectuer les nombreux tests de spectrométrie de masse, Vincent Forge qui m'a initié à la spectroscopie FTIR, Monika Budayova Spano pour ces nombreux conseils en cristallogenèse, et surtout à Susana Teixeira, pour avoir accepter d'intégrer le monde des cristallines. A vous tous, je vous remercie pour votre disponibilité et votre patience, en espérant que ces collaborations continuent. Je souhaite remercier, aussi, les nombreuses personnes des différents laboratoires que j'ai arpentés pour leur patience, pour leur humour, et pour leurs discussions que cela soit de nature techniques ou tout autre. Je souhaite en particulier dire merci à Marie-Thérèse Dauvergne pour son attention constante qu'elle soit personnelle ou professionnelle, et qui m'a convertie aux cristallines, à Flora Meilleur, pour toutes ses ouvertures d'esprits sur les neutrons, à Ingrid Parrot pour sa bonne humeur et son humour toujours présents, à Martine

Moulin qui m'a écouté et m'a souvent conseillé, et à Benoit Gallet, qui m'a laissé tomber

pour rejoindre l'IBS. Ingar Leiros et Gordon Léonard m'ont apporté beaucoup de conseils lors de

l'enregistrement des données expérimentales. A l'époque, mes très incomplètes connaissances

de la diffraction aux rayons X ne m'auraient pas permis de faire seul les bons choix. Je remercie sincèrement les personnes de l'EMBL et de l'ESRF, qui m'ont apporté leurs conseils en cristallographie : Nicolas Tarbouriech, Cyril Dian, Yvain Nicolet, Carlo Petosa, Win Burmeister, Carlos Fernandez Tornero... Un grand merci, à Karine Sultan, Rémi Pink, Benjamin Girardier, Mary Jane Villot, Virginie Bertholet, Annie Simon, Sandrine Mario, Monique Romero, Denis Pognant, Jose Barranco, et François Dauvergne pour leur dévouement dans leurs travaux respectifs, sans lesquels la science serait bien peu de chose. Je tiens à ne pas oublier tous les thésards et amis de l'ILL, de l'EMBL, de l'IAB, et de l'ESRF, pour leur conseils, scientifiques ou non, pour leur soutien, leur réconfort et pour

toute leur aide : Marlyse, Thibault, Nicolas, Lucie, Aurélie, Jeanne, Franck, Philippe, Cédric,

Céline, Annabelle, Cyril(s), Carlos, Momo, Barry, Alex, Titi, Benoit(s), Anne Laure, Gilles,

Mike, Gwladys...

Enfin, ceux qui comptent le plus à mes yeux, je tiens à remercier Armelle et Valentine, ainsi que mes parents, pour leur soutien moral et orthographique. "Advances are made by answering questions.

Discoveries are made by questioning answers."

- Bernhard Haisch, astrophysicist - - i -

Sommaire

Chapitre 1 : Présentation du sujet

Page

Abstract 1

Résumé 3

Chapitre 2 : OEil, cristallin, cristallines et neutrons

Abstract 6

2.1 Le système protéique : les cristallines 7

2.1.1 De l'oeil à la vision 7

2.1.1.1 L'oeil 7

2.1.1.2 Le trajet optique 8

2.1.1.3 le cristallin : un organe exceptionnel 9

2.1.1.3.1 L'organisation du cristallin 9

2.1.1.3.2 Les fibres du cristallin 11

2.1.1.3.3 Réfraction et transparence 12

2.1.2 Les cristallines 14

2.1.2.1 Les cristallines : des protéines 14

2.1.2.2 Les cristallines : les protéines essentielles du cristallin 16

2.1.3 Les cristallines 16

2.1.3.1 Les cristallines : " small Heat Shock Protein » et autres fonctions 17

2.1.3.2 Les cristallines : des oligomères hétérogènes de grande taille 17

2.1.3.3 Les cristallines : cataractes et maladies 17

2.1.4 La super famille des cristallines 18

2.1.4.1 La clef grecque : dénominateur commun des cristallines 18

2.1.4.2 Les cristallines 19

2.1.4.3 La protéine S cristalline 21

2.1.4.4 Les cristallines 21

2.1.4.4.1 Gènes de cristallines 22

2.1.4.4.2 Maladies 22

2.1.4.4.3 Transition de phase des cristallines 23

2.1.4.4.4 Structures des cristallines cryo et non cryo-précipitables 24

2.1.4.5 Evolution de la super famille cristalline 29

2.1.5 L'eau et les cristallines 34

2.1.5.1 L'eau et la biologie 33

2.1.5.2 L'hydratation des cristallines 35

2.2 Pourquoi envisager la cristallographie aux neutrons 36

2.2.1 La visualisation des hydrogènes par la cristallographie aux neutrons 38

2.2.2 Diffusion incohérente des atomes d'hydrogène 40

2.2.3 La réduction du bruit de fond en cristallographie des neutrons 41

2.2.4 Faible flux de neutrons 42

2.2.5 La diffraction polychromatique dite diffraction de Laue 43

2.3 Bilans 45

Bibliographie 46

- ii - Chapitre 3 : Production de cristallines totalement deutériées

Abstract 49

3.1 Expression de cristallines en bio-réacteur 50

3.1.1 Notions essentielles pour les cultures cellulaires 51

3.1.1.1 Apports nutritifs et conditions de culture 51

3.1.1.1.1 La source de carbone 52

3.1.1.1.2 Cas de l'oxygène 52

3.1.1.1.3 Effet de la température 53

3.1.1.1.4 Le pH 54

3.1.1.2 Paramètres de la croissance 54

3.1.1.3 Les phases de croissance : cas d'une culture en " batch » 56

3.1.1.4 La culture en " fed batch » 57

3.1.1.5 La production de protéine recombinante 58

3.1.2 La culture en milieu deutérié 59

3.2 Matériels et méthodes 60

3.2.1 Clones de cristallines disponibles 60

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