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NNT° : 2017 IAVF 0017

THESE DE DOCTORAT

préparée à l'Institut des sciences et industries du vivant et de l'environnement (AgroParisTech)

pour obtenir le grade de

Docteur de

l'Institut agronomique vétérinaire et forestier de France

Spécialité :

Biotechnologies

École doctorale n°581

Agriculture, alimentation, biologie, environnement et santé (ABIES) par

Laetitia CHAN HO TONG

Amélioration du champignon cellulolytique Trichoderma reesei par reproduction sexuée

Directeur de thèse :

Antoine MARGEOT

Co-encadrement de la thèse : Frédérique BIDARD Thèse présentée et soutenue à Rueil-Malmaison, le 26 octobre 2017 :

Composition du jury :

Mme Fabienne MALAGNAC, Professeur, Université Paris Saclay Présidente Mme Joëlle DUPONT, Professeur, Muséum national d'Histoire naturelle Rapporteur M. Marc-Henri LEBRUN, Directeur de recherches, INRA Rapporteur M. Robert DEBUCHY, Directeur de recherches, CNRS Examinateur Mme Muriel VIAUD, Directeur de recherches, INRA Examinateur Mme Frédérique BIDARD, Ingénieur de recherches, IFP Énergies nouvelles Co-encadrante M.

Antoine MARGEOT, Chef du département Biotechnologie, IFP Énergies nouvelles Directeur de thèse

IFP Energies nouvelles - Département Biotechnologie

1 et 4 Avenue de Bois Préau

92

500 Rueil-Malmaison

1

Remerciements

Je remercie chaleureusement mon encadrante,

au long de ces trois ans avec beaucoup

Je remercie

Je remercie

s conseils en BM et en fermentation et pour o Je remercie Frédéricn du département Biotechnologie lors de la soutenance. fermentation.

Je remercie les

Je remercie l

Je remercie l

2 u sein de ce

Merci à mes coéquipiers sportifs

et stimulante que je suis peinée de quitt passage à IFPen.

Je remerci

Je remercie

encouragements et leur intérêt sorte qu qui nous sépare, sa con remercie chaleureusement

Pour terminer

travail mais je sais que tu en aurais été très fier. 3

Table des matières

Table des matières

Liste des figures

Liste des tableaux

Listes des abréviations

Introduction

1. Étude

1.1. Les biocarburants

1.1.1. Contexte climatique et énergétique

1.1.2. La fabrication des biocarburants

1.2.

1.2.1.

1.2.2. Les m

1.2.3. La reproduction sexuée

1.2.4. Le cycle parasexuel et la fusion de protoplastes

1.3. Le champignon Trichoderma reesei

1.3.1. Origines, taxonomie et écologie

1.3.2. Le champignon cellulolytique T.

1.3.3. Les souches hyper

1.4. Reproduction sexuée et cycle de vie chez les souches sauvages de T.

1.4.1. T.

1.4.2. Les types sexuels

1.4.3. Le système phéromone récepteur

1.4.4. Développement des périthèces

1.4.5. Régulation du développement sexuel par la lumière

1.5. Reproduction sexuée et cycle de vie chez la souche industrielle QM6a

1.5.1. QM6a est femelle stérile

4

Remédier à la stérilité femelle

1.6. Enjeux et objectifs de la thèse

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériel biologique

2.2. Milieux et conditions standards de culture

2.3. Étude de la reproduction sexuée

2.3.1. Reproduction sexuée

2.3.2. Observation du cycle de reproduction sexuée

2.3.3. Test MAT

2.3.4.

2.3.5. Test de viabilité des ascospores

2.3.6.

2.3.7. Observation des anastomoses

2.4.

2.5. Transformations

2.5.1. Transformation bactérienne

2.5.2. Transformation fongique par la méthode des protoplastes

2.5.3. Transformation fongique par électroporation des con

2.6. Construction de souches

2.6.1. Invalidation du locus MAT

2.6.2. Remplacement du locus MAT

2.6.3. MAT1

2.6.4. Construction des souches sauvages marquées

2.7.

2.7.1. ADN plasmidique

2.7.2. ADN génomique

2.8. PCR et amorces

2.9. Cri

2.9.1. Crible primaire

5

Crible secondaire

2.9.3. Culture en bioréacteurs de laboratoire

2.9.4.

2.9.5. ȕ-

2.10. BSA

2.10.1. Criblage sur milieu AZCL

2.10.2. Préparation de librairies, séquençage et assemblage du génome de la souche A2

2.10.1. Culture et ext

2.10.2. Séquençage des groupes de descendants et détection des polymorphismes

3. Résultats et discussions

3.1. Maîtrise du cycle sexué

3.1.1. Isolement de souches sauvages des deux types sexuels

3.1.2. Cycle de vie de T. reesei

3.1.3. Récupération, conservation et germination des ascospores

3.1.4. Optimisation de la formation des stromata

3.1.5. Effets de différents milieux sur la

3.1.6. Comparaison des méthodes de croisement

3.1.7. Discussion

3.2. Mise

3.2.1. Stratégie de la "

3.2.2. Prérequis à la stratégie de la souche assistante

3.2.3. Construction des souches outils

3.2.4.

3.2.5.

3.2.6. Discussion

3.3. Mise en application de la reproduction sexuée entre souches sauvages et hyper

3.3.1. La reproduction sexuée pour améliorer les performances cellulolytiques de T. reesei

3.3.2. -

3.3.3. Conclusion et

6

Conclusion et perspectives

5. Références

6. Annexes

7

Liste des figures

Figure 1: Procédé de production d'éthanol de 1ere génération Figure 2 : Procédé de production d'éthanol de 2eme

Figure 3 : Les champignons dans l'industrie.

Figure 4

Figure 5

ue par reproduction sexuée.

Figure 7

Figure 8 : Trichoderma reesei.

Figure 9T. reesei en sept chromosomes.

Figure 10 :

Figure 11: Réarrangements chromosomiques de la souch

Figure 12 : Reproduction sexuée chez un champignon ascomycète filamenteux hétérothalliqu

Figure 13 : Morphologie des fructifications et des ascospores de T..

Figure 14 : Cycle de vie théorique de T.

Figure 15 : Idiomorphes du locus MAT chez T.

Figure 16

Figure 17 : Le système phéromone/récepteur chez les levures. Figure 18 : Le système phéromone/récepteur matingT., P. N.. Figure 19 : Développement des périthèces chez H. gelatinosa. Figure 20 : Développement des périthèces chez H.

Figure 21 : Reproduction sexuée de T.

Figure 22 : La reproduction sexuée chez T. reesei.

Figure 23 :

8 idc1 T.. Figure 25 : Etapes de purification des transformants (IFPEN) Figure 26 : Assemblage final de la cassette de délétion dans le plasmide pUC19.

Figure 27 : Position des amorces choisies pour l'amplification des différents fragments de la cassette

Figure 29ȕ-

Figure 30 : Test Mat ou croisements

Figure 31 : Identification de la souche B31.

Figure 32

Figure 33 : Hyphes entrelacées colorées au Bleu de lactophénol

Figure 34 : Des boules cotonneuses et

Figure 35

Figure 36 : Libération des ascospores

Figure 37

Figure 38

Figure 39 : Méthode de reproduction sexuée par arrosage.

Figure 40 : Récapitulatif des paramètres expérimentés pour optimiser la formation des stromata.

Figure 41: Optimisation de la reproduction sexuée par arrosage. Figure 42 : Quantification des stromata obtenus sur différents milieux de culture.

Figure 43 : Stratégie

Figure 44 : Stratégie de la souche assistante appliquée T. reesei. Figure 45 : Test de la fertilité femelle des souches A2 et B31.

Figure 46 : Validation des prérequis.

Figure 47 : Stratégie de construction des souches outils.

Figure 48 : Les loci MAT T. reesei.

Figure 49ocus MAT1

Figure 50MAT 1

9 MAT1 Figure 52 : Stratégies alternatives pour l'obtention d'une souche MAT1.

Figure 53

Figure 56

Figure 57 : Princi

fécondation Figure 59 : Profils de croissance des ascospores issues des croisements A2 (B31) Figure 60 : Profils de croissance des ascospores issues des croisements B31 (A2)

Figure 6MAT1

Figure 62

Figure 63 : Répartition des individus par classe en fonction de leur production de protéines. Figure 64 : Crible de la production de protéines en fioles alimentées

Figure 65

Figure 66

Figure 67 : Détection par PCR de la troncation du gène cre1.

Figure 68 : Principe de la méthode BSA

Figure

Figure 70

Figure 71

Figure 72 MAT1 MAT1

Figure 73

10

Figure 75 : Cartographie des SNPs sur le gén

Figure 76xyr1

11

Liste des

Tableau 1

Tableau 2: Récapitulatif des avantages et inconvénients des différentes techniques d'amélioration de

Tableau 3 : Comparaison entre la reproduction sexuée et la multiplication clonale

Tableau 4 : Classification de T.

Tableau 5 : Souches utilisées dans ce projet.

Tableau 6 : Récapitulatif des amorces utilisées au cours de ce projet de thèse.

Tableau 7: Taux de germination des ascospores

Tableau 8

Tableau 9: Essais de tricaryon.

Tableau 10

Tableau 12

Tableau 13: Récapitulatif

Tableau 14

Tableau 15

Tableau 16

Tableau 17

12

Listes des a

ADN

Introduction

La demande énergétique mondiale

par un petit mondiale. Parallèlement, il a été démontré que les changements climatique peut être Tri représenter à elle seule entre 15 et 30

domaine des biocarburants utilisent des souches du champignon filamenteux Trichoderma reesei

cellulases ont été mises en place plus récemment. Des souches améliorées pour leur productivité ou

et la difficulté de leur recyclage réduisent les modifications possibles. T. sexuée 15 M6a présente un problème de stérilité

rapide et efficace, mais si elle ne peut pas avoir lieu entre les souches industrielles, son utilité reste

if de ce

T.. Une première partie de mon

reproduction sexuée sauvages et hyper le de la vise à tirer parti es mutations impliquées dans s

1. Étude

17

1.1. Les

1.1.1. Contexte climatique et énergétique

La demande

croissance démographique et économique de certains pays émergents (BP, 2015)

abondantes, mais concentrées dans un petit nombre de pays, ce qui soulève la question de la sécurité

des catastrophes naturelles, des incidents techniques (catastrophe i pourrait atteindre 5,5 internationale a décidé de freiner la hausse des températures à 2

émissions de gaz à

considérable, Le présent travail est focalisé plus spécifiquement sur les 18

1.1.2. La fabrication des b

Les biocarburants sont issus de la transformation de

végétale. Ils sont utilisés soit en remplacement, soit en complément des carburants conventionnels

ils , car sous ils sont simples à peuvent être matières premières nécessaires à

1.1.2.1. La p

L le biodiesel, destiné aux moteurs diesel, le bioéthanol extrait du maïs, Ethyl Tertio obutène , afin de

Figure

ere 19

Figure

Lblé est fermenté en

1.1.2.2. La d

Les biocarburants de

ou même des plantes dédiées à pour les biocarburants de première génération et elle se répartit en deux filières : lvoie thermoch 20 lvoie biochimique . Chacune des

Trichoderma reesei.

simultanées ou séquentielles..

2 de 70 %

Figure e .

De nombreux programmes

préindustrielles 21

1.1.2.3. Troisième génération

Les biocarburants de 3e

produisent 2 terrestres en accaparant pas ou peu de surfaces agricoles. . L s des stratégies de cultures actuelles, plus

1.1.2.4. Conclusion

Le biocarburant de deuxième génération est, hormis celui de la première, la génération la plus

politiques et des scientifiques. Même si toutes les étapes de ce procédé doivent être optimisées, un

t en jeu les enzymes du

T.. Parmi les améliorations envis

T. champignon produisant par exemple p

Même si le champignon filamenteux qui nous intéressera dans la suite de cet exposé est T., il est

tilisé 22
Les -s s s

sans ces organismes à fort potentiel de biotransformation. Le vin et la bière sont ainsi obtenus

S S,

Aspergillus oryzae

S. . Si la fabrication du fromage ne repose pas directement sur les capacités

Penicillium camenberti(

P. Quant aux sauciss

développement à leurP

Figure

S. cerevisiae(A), P. forme la croûP. chrysogenum (C) et T. harzianum (D). 23
e Penicillium notatum (aussi appelé P chrysogenumFigure (statines), sécrété s molécules S. les papillomavirus humains. S. ) produits. http://www.novozymes.com utilisé

Trichoderma Aspergillus(Paloheimo et al., 2016)

divers p

T. reesei

textile 24

Tableau

quotesdbs_dbs29.pdfusesText_35

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