[PDF] Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3

Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 1 plaque - 96 72340 5 plaques - 480 72341 TROUSSE DE DÉPISTAGE DES ANTICORPS ANTI-VHC (VIRUS DE L'HÉPATITE C) DANS LE SÉRUM OU LE PLASM A HUMAIN PAR TECHNIQ UE IMMUNOENZYMATIQUE

883635

2 Table des Matières 1. UTILISATION PREVUE ....................................................................................... 3 2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST ............................................................... 3 3. PRINCIPE DU TEST ............................................................................................ 3 4. REACTIFS ........................................................................................................... 4 5. AVERTISSEMENTS ET MESURES DE PRECAUTION ..................................... 5 6. ECHANTILLONS ................................................................................................. 6 7. MODE OPERATOIRE .......................................................................................... 7 8. LIMITES DU TEST ............................................................................................. 10 9. CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ................................................. 10 10. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................. 12

3 1. UTILISATION PREVUE : Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 est un test qualitatif immunoenzymatique de type indirect permettant le dépistage des anticorps associés à une infection par le virus de l'hépatite C (VHC) dans le sérum et le plasma humain. Ce test , destiné au dépi stage de l'hépatite C, peut être util isé par l es laboratoires de diagnostic et les banques de sang. 2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST : Le virus de l'hépatite C (VHC) est un virus à enveloppe, à ARN de sens positif (9,5 kb), appartenant à la famille des Flaviviridae. Isolé en 1989, six génotypes majeurs du VHC ont été identifiés. Le VHC est reconnu comme la principale cause des hépatites virales non-A et non-B. L'infection par le VHC se caractérise par une forme aiguë et une forme chronique qui peut évoluer vers une cirrhose et parfois vers des carcinomes hépatocellulaires. Le dépistage d'une hépatite C repose sur l'utilisation en première ligne d'un test immuno-enzymatique de type ELISA de troisième génération pour la détection des anticorps anti-VHC. 3. PRINCIPE DU TEST : Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 repose sur l'utilisa tion d'u ne phase solide préparée avec des antigènes purifiés : trois protéines recombinantes de la région non structurale (NS3 et NS4), un peptide de la région structurale (capside) du virus de l'hépatite C et d'une phase liquide (conjugué) constituée d'anticorps murins anti-IgG humaines purifiés et couplés à la peroxydase. La mise en oeuvre du test comprend les étapes réactionnelles suivantes : 1) Le diluant échantillon (R6) puis les échantillons et les contrôles (R3 et R4) sont distribués dans les cupules. Si des anticorps anti-VHC sont présents, ils se lient aux antigènes fixés sur la phase solide. 2) Après une inc ubation de 1 heure à 37°C et une étape de lavage , le conjugué (R7) contenant des anticorps anti-IgG humaines marqués à la peroxydase est ajouté. En présence d'IgG humaines ayant réagi avec la phase solide, le conjugué anti IgG humaines se lie aux anticorps humains. 3) Après 30 minutes d'incubation à 37°C et élimination du conjugué enzymatique non lié par lavage, la présence des complexes antigène-anticorps-peroxydase sont révélés par addition du substrat. 4) Après 30 minutes d'incubation à température du laboratoire (18-30°C) et arrêt de la réaction, la lecture s'effectue au spectrophotomètre à 450/620-700 nm. L'absorbance mesurée pour un échantillon permet de conclure quant à la présence ou l'absence d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon testé. L'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d'anticorps anti-VHC liés sur la phase solide.

4 4. RÉACTIFS : 4.1. Description : Identification de l'étiquetage Description Présentation / Préparation 72340 Présentation / Préparation 72341 R1 MICROPLATE Microplaque 12 barrettes sensibilisées avec des antigènes recombinants purifiés (NS3, NS4) et un peptide de la région capside du VHC Identifiant spécifique = 94 1 plaque Prêt à l'emploi 5 plaques Prêt à l'emploi R2 CONCENTRATED WASHING SOLUTION (20X) Solution de lavage concentrée 20 fois Tampon Tris NaCl pH 7,4 Conservateur : ProClin™ 300 (0,04%) 1 flacon (70 ml) A diluer 1 flacon (235 ml) A diluer R3 NEGATIVE CONTROL Contrôle négatif Tampon Tris HCl, contenant de la S.A.B. (albumine de sérum bovin) Conservateur : ProClin™ 300 (0,1%) 1 flacon (1 ml) Prêt à l'emploi 1 flacon (1 ml) Prêt à l'emploi R4 POSITIVE CONTROL Contrôle positif Sérum humain contenant des anticorps anti-VHC, négatif pour l'antigène HBs et pour les anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2, dilué dans un tampon Tris HCl contenant de la S.A.B. et inactivé photochimiquement Conservateur : ProClin™ 300 (0,1%) 1 flacon (1,5 ml) Prêt à l'emploi 1 flacon (3 ml) Prêt à l'emploi R6 SAMPLE DILUENT Diluant Echantillon Tampon citrate; coloré en violet. Conservateur : Azide de sodium (<0,1%), Cosmocil® CQ (0,025%) 1 flacon (15 ml) Prêt à l'emploi 2 flacons (2 x 30 ml) Prêt à l'emploi R7 CONJUGATE Conjugué Anticorps murins anti-IgG humaines marqués à la peroxydase Coloré en vert. Conservateur : ProClin™ 300 (0,5 %) 1 flacon (15 ml) Prêt à l'emploi 2 flacons (2 x 30 ml) Prêt à l'emploi R8 SUBSTRATE BUFFER Substrat Solution d'acide citrique et d'acétate de sodium, pH 4,0, contenant 0,015% d'H2O2 et 4% de diméthylsulfoxyde (DMSO) 1 flacon (60 ml) A reconstituer 2 flacons (2 x 60 ml) A reconstituer R9 CHROMOGEN : TMB SOLUTION (11X) Chromogène : solution TMB Solution contenant du 3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) 1 flacon (5 ml) A reconstituer 2 flacons (2 x 5 ml) A reconstituer R10 STOPPING SOLUTION Solution d'arrêt Solution d'acide sulfurique (H2SO4 1N) 1 flacon (28 ml) Prêt à l'emploi 3 flacons (3 x 28 ml) Prêt à l'emploi 4.2. Conditions de conservation et de manipulation : La trousse doit être gardée à +2-8°C. Chaque élément de la trousse conservé à +2-8°C peut être utilisé jusqu'à la date de péremption indiquée sur le coffret (sauf indication spécifique). Après ouverture et en l'absence de contamination, les réactifs R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 et R10 conservés à 2-8°C sont stables jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'étiquette.

5 Identification Conservation R1 Après ouverture du sachet sous vide, les barrettes conservées à +2-8°C sont stables pendant 1 mois dans leur sachet d'origine refermé avec soin R2 La solution de lavage diluée peut être conservée à +2-30°C pendant 2 semaines. La solution de lavage concentrée (R2) peut être conservée à +2-30°C. R8 + R9 Après reconstitution, les réactifs conservés à l'obscurité sont utilisables pendant 6 heures à la température ambiante (18-30°C). 5. AVERTISSEMENTS ET MESURES DE PRECAUTION : Pour utilisation en diagnostic in vitro par un professionnel de santé. 5.1. Précautions relatives à la santé et à la sécurité : • Ce coffret doit être manipul é uniquement par du per sonnel qualifié form é aux procédures de laboratoire et familier avec leurs risques potentiels. Porter des vêtements protecteurs appropriés, gants et protection des yeux/visage et manipuler de manière appropriée selon les bonnes pratiques de laboratoire requises. • La trousse contient des composants du sang humain. Le matériel d'origine humaine utilisé dans la préparation du réactif R4 (Positive Control) a été testé et trouvé non-réactif en antigène de surface du virus de l'hépatite B (Ag HBs), et en anticorps dirigés contre les virus de l'immunodéficience humaine (anti VIH-1 et anti VIH-2) et réactif en anticorps dirigés contre le virus de l'hépatite C (anti-VHC). De ce fait, il a été inactivé photochimiquement. Aucune méthode d'analyse connue ne peut offrir une complète assurance que des agents infectieux sont absents. Par conséquent, tous les dérivés du sang humain, réactifs et échantillons humains, doivent être manipulés comme s'ils étaient capables de transmettre une mala die infectieuse, en suivant les préca utions univer selles recommandées pour les pathogènes sanguin comme définies par OSHA, les guides actualisés du CDC/NIH Biosaf ety in Microbiological and Bi omedical Laboratori es et/ou les réglementations nationales, régionales et locales. • Projections Biologiques : le s projections de matériel humain doivent être tra itées com me potentiellement infectieuses. Les projections ne contenant pas d'acide doivent être immédiatement décontaminées (incluant la zone de projection, le matériel et toute surface contaminée ou équipement) avec un désinfectant chimique approprié qui d oit être efficace pour les risque s potentiels r elatifs aux échan tillons impliqués (communément une dilution à 1:10 d'eau de Javel, 70-80% Ethanol ou Isopropanol, un iodophor [tel que 0,5% Wescodyne™ Plus, etc.), et séchées. Les projections contenant de l'acide doivent être absorbées (essuyées) de manière appropriée ou neutralisées, la zone lavée avec de l'eau et séchée; le matériel utilisé pour absorber la projection peut nécessi ter d'être jeté dans une poubelle pour r isque biologique. E nsuite l a zone doit être décontaminée avec un des désinfectants chimiques. NOTE : Ne pas mettre des solutions contenant de l'eau de Javel dans l'autoclave ! • Jeter tous les échantillons et le matériel utilisés pour réaliser le test comme s'ils contenaient un agent infectieux. Les déchets de laboratoire, chimiques ou biologiques doivent être manipulés et jetés selon les réglementations locales, régionales et nationales. • Pour les risques et recommandations de précaution relatifs à certains composants chimiques dans cette trousse, mer ci de vous référer au( x) pictogramme(s) indiqué(s) sur les étiquettes et à l'information fournie à la fin de la notice. La fiche de données de sécurité du produit est disponible sur www.bio-rad.com.

6 5.2. Précautions relatives au protocole : 5.2.1. Préparation : La qualité des résultats dépend du respect des bonnes pratiques de laboratoire suivantes : • Ne pas utiliser des réactifs dont la validité est expirée. • Ne pas mélanger des réactifs de lots différents au cours d'un même essai. • Avant utilisation, sortir les réactifs de la boite et attendre 30 minutes que les réactifs s'équilibrent à la température ambiante (18-30°C). • Le nom du test ainsi qu'un numéro d'identification spécifique du test sont mentionnés sur le cadre de chaque microplaque. Ce numéro d'identification spécifique figure également sur chaque barrette. Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 : Numéro spécifique d'identification = 94 Cette identifica tion doit être vérifiée avant chaque utilis ation. Toute barrette dont le numéro de t est est absent ou différent de celui correspondant au test réalisé, ne doit pas être utilisée. REMARQUE : Il est p ossible d'utiliser d'autres lots de so lution de lavage (R2, ide ntifié 20X en vert sur l'étiquette), de tampon substrat (R8, identifié TMB buf. en bleu), de chromogène (R9, identifié TMB 11X en violet) et de solution d'arrêt (R10, identifié 1N en rouge), que ceux fournis dans la trousse sous réserve d'utiliser un seul et même lot de ceux-ci au cours d'une même série. Ces réactifs peuvent être utilisés avec d'autres produits de notre s ociété. Contacter nos s ervi ces techniques pour obteni r des inf ormations détaillées. • Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination. • Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de préférence du matériel à usage unique. • Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du lavage et la distribution des réactifs. • La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ions métalliques. En conséquence, aucun élément métallique ne doit ent rer en contact avec les diff érentes solutions c ontenant le conjugué ou la solution substrat. • La solution de révélation (tampon substrat + chromogène) doit être colorée en rose. L'apparition d'une autre coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé. • Pour cette pr éparation, utilis er de préférence des récipients et du mat ériel de distribution en plastique à usage unique ou de la verrerie préalablement lavée à l'acide chlorhydrique 1N, rincée à l'eau distillée et séchée. Conserver cette solution à l'abri de la lumière. • Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solution de révélation. 5.2.2. Réalisation : • Ne pas changer le mode opératoire • Ne pas réaliser le test en présence de vapeur s réactiv es (acides, al calines, aldéhydes) ou de poussières qui pourraient altérer l'activité enzymatique du conjugué. • Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque sérum. • Le lavage des cupules est une étape essentielle de la manipulation : respecter le nombre de cycles de lav ages prescrits et s'assurer que toutes les cupules soient complèt ement remplies, puis complètement vidées. Un mauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects. • Pour des performances optimales, suivre attentivement les procédures de lavage décrites. Selon les instruments, il peut être nécessaire d'optimiser la procédure de lavage (augmentation du nombre d'étapes de cycles de lav age et/ou le volume de la solution de lav age pour chaque cycl e) afin d'obtenir un niveau acceptable de bruit de fond pour les échantillons négatifs. • Contacter Bio-Rad pour l'adaptation et les procédures spéciales. 6. ECHANTILLONS : Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage. Les tests sont effectués sur des échantillons non dilués de sérum ou de plasma (collectés sur EDTA, héparinate de Lithium, Citrate de Sodium ou ACD). Les échantillons présentant des agrégats doivent être clarifiés par centrifugation avant le test. Les particules ou agrégats de fibrine en suspension peuvent donner des résultats faussement positifs. Les échantillons seront conservés à +2-8°C si le dépistage est effectué dans les 7 jours ou peuvent être conservés congelés à -20°C. Eviter les congélations/décongélations répétées (au-delà de 3 cycles de congélation /décongélation).

7 Les échantil lons doivent être décongelés à tempér ature ambiante (18-30°C). Il est rec ommandé de les homogénéiser par retournement avant utilisation. Les échantillons contenant jusqu'à 120 g/l d'albumine, 200 mg/l de bilirubine, les échantillons lipémiques contenant jusqu'à l'équivalent de 33 g/l de trioléine et les échantillons contenant jusqu'à 2 g/l d'hémoglobine n'affectent pas les résultats. Il est cependant recommandé de ne pas utiliser des échantillons contaminés, hyper lipémiques et hyper hémolysés. Si les échantillons doivent voyager, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents étiologiques et les transporter préférablement congelés. Le chauffage des échantillons n'est pas recommandé. 7. MODE OPERATOIRE : 7.1. Equipement nécessaire mais non fourni : • Eau distillée ou complètement déminéralisée. • Eau de javel et bicarbonate de soude. • Papier absorbant. • Films adhésifs. • Gants à usage unique. • Lunettes de protection. • Tubes à usage unique. • Pipettes automatiques ou semi-automatiques réglables ou fixes pouvant distribuer 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl et 1 ml. • Eprouvettes graduées de 10 ml, 200 ml et 1 000 ml. Agitateur type vortex. • Système de lavage, automatique*, semi-automatique* ou manuel pour microplaque. • Bain-marie, ou incubateur sec*, pouvant être thermostaté à 37°C ± 1°C • Conteneur de déchets contaminés. • Appareil de lecture* pour microplaques (équipés de filtres 490, 620, 450/620-700 nm). (*) Nous consulter pour une information précise conc ernant les ap pareils vali dés par nos services techniques. 7.2. Préparation des réactifs : 7.2.1. Réactifs prêts à l'emploi : Réactif 1 (R1) : Microplaque Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionné en sachet aluminium scellé. Couper le sachet à l'aide de ciseaux ou scalpel 0,5 à 1 cm au-dessus de la soudure. Ouvrir le sachet et sortir le cadre. Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8°C. Réactif 6 (R6) : Diluant échantillon Homogénéiser par retournement avant utilisation. Réactif 7 (R7) : Conjugué Homogénéiser par retournement avant utilisation. 7.2.2. Réactifs à reconstituer : Réactif 2 (R2) : Solution de lavage concentrée (20X) Diluer 20 fois la solution dans l'eau distillée. On obtient ainsi la solution de lavage prête à l'emploi. Prévoir 800 ml pour une plaque de 12 barrettes. Réactif 8 (R8) + Réactif 9 (R9) : Solution de révélation enzymatique Diluer le réactif R9 dans le réactif R8 au 1/11e (exemple : 1 ml de réactif R9 dans 10 ml de réactif R8) sachant que 10 ml sont nécessaires et suffisants pour traiter 12 barrettes. Homogénéiser.

8 7.3. Protocole opératoire : Suivre strictement la procédure. Utiliser les sérums des contrôles positifs et négatifs pour chaque test afin de valider la qualité du test. Suivre les Bonnes Pratiques de Laboratoire suivantes : 1) Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des échantillons. 2) Préparer la solution de lavage diluée R2. 3) Sortir le cadre support et les barrettes (R1) de l'emballage protecteur. Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8°C. 4) Déposer directement, sans prélavage de la plaque, successivement : • 100 µl de diluant échantillon (R6) dans chaque cupule puis • 50 µl de contrôle négatif (R3) en A1, • 50 µl de contrôle positif (R4) en B1, C1, D1, • 50 µl du premier échantillon en E1, • 50 µl du deuxième échantillon en F1, etc... Homogénéiser le mélange par 3 aspirations minimum ou avec un agitateur de microplaque durant 5 secondes. Si la distribution des échantillons excède 10 mn, il est alors recommandé de distribuer les contrôles négatifs et positifs après les échantillons à tester. En fonc tion du système utilisé, il est possible d e modifie r la position ou l'or dre de di stribution des contrôles. REMARQUE : Après ajout de l'échantillon, le diluant vire du violet au bleu. Il est possible de vérifier par lecture spectrophotométrique à 620 nm la présence des échantillons dans les cupules. (Se référer §7.7) 5) Couvrir si possible d 'un film autocollant en appuyant bi en sur toute la surface pour assurer l'étanchéité. 6) Incuber la microplaque pendant 60 minutes (± 5 min.) à 37°C ± 1°C. 7) Si nécessaire, retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés (contenant de l'hypochlorite de sodium) et ajouter dans chacune d'elles un minimum de 0,370 ml de solution de lavage. Aspirer de nouveau. Répéter le lavage au moins 4 fois (au total, au moins 5 lav ages sont effectués). Le volume rés iduel doit être inférieur à 10 µl (si nécessaire, sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant). Si l'on dispose d'un laveur automatique, respecter le même cycle opératoire. 8) Distribuer rapidement 100 µl de la solution de conjugué (R7) dans toutes les cupules. Le conjugué doit être agité avant emploi. Recouvrir, si possible, d'un film neuf et incuber pendant 30 minutes (± 5 min.) à 37°C ± 1°C. REMARQUE : Le conj ugué est d'une col oration verte. Il est poss ible de vérifier par lec ture spectrophotométrique à 620 nm la présence du conjugué dans les cupules (Se référer §7.7) 9) Si nécéssaire, etirer le film adhésif, vider toutes les cupules par aspiration et laver 5 fois comme précédemment 10) Préparer la solution de révélation (réactif R8 + R9). 11) Distribuer rapidement dans tou tes les cupules 80 µl de la solution de révélation de l'activi té enzymatique (R8 + R9) préalablement préparée. Laiss er l a réaction se dév elopper à l'obscurité pendant 30 minutes (± 5 min.) à température ambiante (18 à 30°C). Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif. REMARQUE : La distribu tion de la solution de révélation q ui est col orée en r ose, peut être contrôlée visuellement. (Se référer §7.7) 12) Ajouter 100 µl de la solution d'arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de distribution que pour la solution de révélation. REMARQUE : La distribution de la solution d'arrêt, qui est incolore, peut être contrôlée visuellement à ce stade de la manipulation. La coloration du substrat, rosée (pour les échantillons négatifs) ou bleue (pour les échantillons positifs), disparaît des cupules qui de viennent incolores (pour les é chantillons né gatifs) ou jaunes (pour les échantillons positifs) après addition de la solution d'arrêt.

9 13) Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Attendre au moins 4 minutes après la distribution de la solution d'arrêt, et, dans les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique à 450/620-700 nm à l'aide d'un lecteur de plaques 14) S'assurer avant la transcri ption des résultat s de la concordance entre la lecture et le pla n de distribution et d'identification des plaques et des échantillons. 7.4. Contrôle qualité : Utiliser le contrôle positif (R4) et le contrôle négatif (R3) dans chaque série de test pour valider l'essai. (Se référer §7.5). 7.5. Critères de validation du test : Le test est validé si les conditions ci-dessous sont respectées : 1) Pour le contrôle négatif (R3) : La valeur d'absorbance mesurée doit être inférieure à 60% de la valeur seuil : DO < Valeur Seuil (VS) x 0,6 2) Pour le contrôle positif (R4) : 0,800 ! Moyenne de DO R4 ! 2,700 Si l'un e des valeurs ind ividuelles d u contrôle positif (R4) s'écarte de plus de 30 % de la moyenne, refaire le calcul avec les deux valeurs de contrôle positif restantes. 7.6. Calcul / Interprétation des résultats : La valeur seuil est déterminée à l'aide du contrôle positif R4 : Calculer la moyenne des absorbances mesurées pour le contrôle positif R4 Calcul de la Valeur Seuil (VS) : VS = Moyenne DO R4 X 0.4 La présence ou l'absence des anticorps anti-VHC est déterminée en comparant pour chaque échantillon l'absorbance enregistrée à celle de la valeur seuil calculée. Pour chaque échantillon, le ratio suivant est calculé : Ratio = DO de l'échantillon / Valeur Seuil Les échantillons dont la densité optique est inférieure à la valeur seuil sont considérés négatifs (ratio < 1) d'après le test Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Toutefois, les résultats situés juste au-dessous de la valeur seuil (VS-10 % < DO < VS, ratio compris entre 0.9 et 1) doivent être interprétés avec prudence et il est conseillé de tester de nouveau les échantillons correspondant en double lorsque les systèmes utilisés et les procédures du laboratoire le permettent. Les échantillons dont la densité optique est supérieure ou égale au seuil (ratio ! 1) sont considérés comme initialement positifs et doivent être re-testés en double avant l'interprétation finale. Après répétitio n de l'essai, l'échantillon est c onsidéré positif d'après le test Mo nolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 si la deuxième et/ou la troisième mesure est (sont) positive(s), c'est-à-dire supérieure ou égale à la valeur seuil. L'échantillon est considéré négatif si ces deux valeurs sont trouvées inférieures à la valeur seuil. Les échantillons qui ont été testés 2 fois et trouvés négatifs avec le test Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, mais dont l'une des deux valeurs de ratio est proche de la valeur seuil (ratio compris entre 0.9 et 1), doivent être interprétés avec prudence. Il est conseillé de re-tester le patient avec un autre prélèvement ou avec une autre technique. Dans le cas où des échantillons testés ont des densités optiques très faibles (DO négative) et que leur présence a été contrôlée ainsi que celle des réactifs, alors les résultats peuvent être interprétés comme négatif. Il est conseillé de confirmer les échantillons positifs conformément aux recommandations et algorithmes nationaux en vigueur.

10 7.7. Vérification spectrophotométrique du dépôt des échantillons et du conjugué (optionnel) : Vérification du dépôt du diluant échantillon (R6) et des échantillons lors de la première étape La présence simultanée du diluant (R6) et de l'échantillon (ou du contrôle) peut être vérifiée par une lecture spectrophotométrique à 620 nm. Chaque puits contenant simultanément le (R6) et un échantillon (ou un contrôle) doit présenter une densité optique supérieure à 0,800. REMARQUE : après ajout de l'échantillon, le (R6) vire du violet au bleu Vérification du dépôt du conjugue (R7) lors de la deuxième étape Remarque : le conjugué (R7) est de coloration verte. La prés ence de conjugué (R7) dans les cupules peut êtr e vérifiée par lect ure spectr ophotométrique à 620 nm. La valeur de DO mesurée pour chaque cupule devra être supérieure à 0,300 (une valeur se situant en dessous de cette norme indique une mauvaise distribution du conjugué). Vérification du dépôt de la solution de révélation Il est possible de vérifier la présence de la solution de révélation rosée par lecture automatique à 490 nm. Une cupule contenant la solution de révélation doit avoir une densité optique supérieure à 0,100 (une DO plus faible indique une mauvaise distribution de la solution de révélation) Il y a une différence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de révélation rosée. 8. LIMITES DU TEST : En raison de la diversité des réponses immunologiques des patients infectés par le virus de l'hépatite C (notamment lors de séroconversions), des différences de détection entre tests peuvent être observées en fonction de la nature des protéines antigéniques utilisées. Un résultat analytique négatif lors d'un test de dépistage n'exclut donc pas la possibilité d'une exposition ou d'une infection par le virus de l'hépatite C. Selon la littérature des patients porteurs du VHC sous traitement immunosuppresseur ou co-infectés VIH-VHC pourraient présenter des niveaux d'anticorps particulièrement bas, inférieurs à la limite de détection des tests anti-VHC. Toute technique ELISA peut produire des réact ions faussement p ositives. Il es t conseillé de vérifier la spécificité de la réaction pour tout échantillon trouvé positif répétable, selon les critères d'interprétation de la trousse Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 par une méthode appropriée : utilisation d'un test ELISA de dépistage des anticorps anti-VHC seul ou par un test Immuno-Blot pour prouver la présence d'anticorps anti-VHC. Si nécessaire, utiliser un test de biologie moléculaire de dépistage du génome viral du VHC. La méthode colorimétrique de vérification du dépôt des échantillons et/ou du conjugué et/ou de la solution de révélation ne permet pas de vérifier l'exactitude des volumes distribués mais seulement de montrer la présence d'échantillon et/ou du conjugué et/ou de la solution de révélation. Le taux de réponses erronées obtenues avec cette méthode est lié à la précision du système utilisé (des CV cumulés de pipetage et de lecture supérieurs à 10% peuvent dégrader significativement la qualité de cette vérification). L'utilisation du test Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 n'est pas validée sur des pools d'échantillons ou des échantillons dilués. De fines particules ont pu être exceptionnellement observées dans le diluant échantillon (R6), leur présence n'altère en aucun cas la qualité du réactif. 9. CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES : 9.1. Mesure de fidélité : La répét abilité et la fidélité intermédi aire ont ét é déterminées à l'aide d'échantillons à dif férentes concentrations en anticorps anti-VHC. Les échantillons ont été testés à 30 reprises lors d'une même série pour déterminer la répétabilité. Les échantillons ont également été testés en double pendant 20 jours à raison de 2 essais par jour. Les moyennes, les écart-types et les coefficients de variation (CV) ont été déterminés sur les ratios.

11 9.1.1. Répétabilité : Echantillons N Ratio moyen Ecart Type CV % Négatif 30 0,12 0,006 4,5 Positif faible anti-VHC 30 1,29 0,059 4,6 Positif faible anti-VHC 30 1,33 0,112 8,4 Positif fort anti-VHC 30 3,60 0,191 5,3 Les CV obtenus sur les échantillons positifs sont inférieurs à 10%. 9.1.2. Fidélité intermédiaire : Echantillons N Ratio moyen Intra essai Inter essai / opérateur Inter jour Reproductibilité totale ET CV % ET CV % ET CV % ET CV % Négatif 120 0,13 0,009 7,3 0,011 8,5 0,005 3.9 0,015 11,8 Positif faible anti-VHC 120 1,40 0,053 3,8 0,119 8,5 0* N.A 0,130 9,3 Positif faible anti-VHC 120 1,48 0,082 5,6 0,120 8,1 0* N.A 0,145 9,8 Positif fort anti-VHC 120 3,57 0,141 4,0 0,173 4,8 0* N.A 0,223 6,2 *La valeur de variance négative est estimée à 0. Les CV obtenus sur les échantillons positifs sont inférieurs à 15%. 9.2. Performances cliniques : Les perform ances du test Monolisa™ anti-HCV PLUS Version 3 o nt été déterminées en an alysa nt des échantillons provenant de donneurs de sang, de patients hospitalisés, de patients souffrant d'infection aigue et chronique pour le virus de l'hépatite C, et de patients présentant des signes cliniques sans rapport avec l'infection par le virus de l'hépatite C. Les études ont été réalisées sur 2 sites de dons de sang, sur un site hospitalier ainsi que sur le site de Bio-Rad. 9.2.1. Spécificité diagnostique : L'étude a été réalisée sur des échantillons de sérum et de plasma EDTA recueillis auprès de 2 centres de dons sur des donneurs non sélectionnés. Une étude de spécificité a également été réalisée sur des échantillons provenant de patients hospitalisés. Tous les échantillons ont été testés avec un test anti-VHC marqué CE. Population Site Type d'échantillon Nombre Echantillons initialement réactifs (IR) Echantillons répétés réactifs (RR) Spécificité (%) Intervalle de confiance 95% Donneurs de sang #1 sérum* 2641* 2 2 2636/2638 #2 sérum 537 1 1 536/537 plasma 2002 4 1 2001/2002 #1 + #2 5180* 7 4 5173/5177 99,92% 99,80 - 99,98 Patients hospitalisés #3 sérum 502 0 0 502/502 100% 99,30 - 100,00 * 3 donneurs trouvés indéterminés avec le test de référence ont été retirés des calculs.

12 9.2.2. Sensibilité diagnostique : La sensibilité diagnostique a été étudiée sur 559 échantillons provenant de patients infectés par le virus de l'hépatite C dont 465 représ entant différents génotypes (1, 2, 3, 4, 5, 6). Parmi c es échantil lons, 25 provenaient de patients prélevés dans les 24 heures précédant le dosage. Table 1 : Génotypes testés Genotypes 1 2 3 4 5 6 Total (1, 1a, 1a/b, 1b) (2, 2a/c, 2a, 2b, 2b/3) (3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r) (5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n) N 230 51 107 63 8 6 465 La sensibilité diagnostique sur l'ensemble des échantillons testés est de 100% (559/559) avec un intervalle de confiance à 95% de [99,3 - 100%]. Echantillons chez des patients présentant une infection aigue : La sensibilité clinique a également été étudiée sur 38 panels commerciaux de séroconversion (dont 9 profils capside, 10 profils NS3 et 19 profils multiples) par comparaison à un test marqué CE pris comme référence.. Parmi ces 38 seroconversions, 1 panel n'a pas été détecté avec le test Monolisa™Anti -HCV PLUS Version 3 et également avec le test pris en comparaison. Sur les 37 panels détectés avec le test Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, 11 séroconversions ont été détectées plus précocement, 25 ont donné une détection équivalente et 1 avait un échantillon en retard. 9.3. Spécificité analytique / réactions croisées : 283 échantillons potentiellement interfér ents, contenant des anticorps dirigés cont re des pathogènes pouvant entrainer des maladies infectieuses (Cytomégalovirus, virus Epstein Barr, virus de la varicelle / zona, virus de la rougeole, virus de la rubéole, virus des oreillons, virus de l'herpès, virus de la grippe, virus de l'hépatite A, virus de l'hépatite B, VIH 1/2, HTLV 1/2, Syphilis, Toxoplasma gondii, Dengue, Chagas), des échantillons issus de groupes à risque (patients dialysés, atteints de cirrhose non hépatiques, de femmes enceintes, de femmes multipar es) ou d'échantillons provenant de pat ients présentant des désordres en relation avec le système immunitaire (auto anticorps, facteurs rhumatoïdes, anticorps anti-souris, myélomes) ont été testés avec le test Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Aucun échantillon n'a été trouvé positif avec le test Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. La spécificité observée sur cette population ciblée es t de 100% (283/283) co rrespondant à celle obte nue sur une population générale. 9.4. Effet crochet : L'existence d'un possible effet crochet a été étudiée en testant 5 échantillons à titres élevés à différentes dilutions. L'équivalence de résultats observés entre les échantillons non dilués et dilués indique l'absence d'effet crochet. 10. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES : • ALBORINO F., BURIGHEL A., TILLER F.W., VAN HELDEN J., GABRIEL C., RAINERI A., CATAPANO R., STEKEL H. Multicenter evaluation of a fully automated third-generation anti-HCV antibody screening test with excellent sensitivity and specificity. Med. Microbiol. Immunol. 2011, 200 : 77-83. • BHARTIA A.R., LETENDREA S.L., WOLFSONA T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52 : 328-332. • CHEN-JI H., HWEI-LING P., CHIH-YU C. Improving Antigenicity of the Recombinant Hepatitis C Virus Core Protein via Random Mutagenesis. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 2011 : 359042. • CHING W.M., WYCHOWSKY C., BEACH M.J., WANG M., DAVIES C.L., CARL M., BRADLEY D.W., ALTER M.S., FEINSTONE S.M., WAI-KUO SMIM J. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural protein region of hepatitis C virus

13 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1992, 89 : 3190-3194. • CHOO Q.L., RICHMAN K.H., HAN J.H., BERGER K., LEE C., DONG C., GALLEGOS C., COIT D., MEDINA-SELBY A., BARR P.J., WEINER A.J., BRADLEY D.W., KUO G. and HOUGHTON M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88 : 2451-2455. • EASL EASL Clinical Practice Guidelines : Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2) : 245-64. • NASOFF M.S., ZEBEDEE S.L., INCHAUSPE G., PRINCE A.M. Identification of an immudominant epitope within the capsid protein of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, June 1991, 88 : 5462-5466. • RIDER P.J. and LIU F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10 : 32. • STRADER DB, WRIGHT T, THOMAS DL, SEEFF LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : 1147-1171. • WIDELL A., BUSCH M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49 : 1277-1281. • ZACHARY P., ULLMANN M., DJEDDI S., WENDLING M.-J., SCHVOERER E., STOLL-KELLER F., GUT J.-P. Evaluation of two commercial enzyme immunoassays for diagnosis of hepatitis C in the conditions of a virology laboratory. Pathologie Biologie, 2004, 52 (2004) : 511-516.

18 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/09 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 883635 www.bio-rad.com