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Laboratoire de Virologie, CHU Caen
Université de CAEN NORMANDIE
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ACADÉMIE NATIONALE DE PHARMACIE
Séance thématique
Paris, 15 mars 2017
VIROLOGIE HOSPITALIÈRE ET BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Méthodes de diagnostic virologique dites "conventionnelles» : oCulture in vitro : nombreuses limites en pratique diagnostique, nombreux virus non cultivables, technique en recul, cependant, intérêt de maintenir les compétences oDétection des antigènes viraux Diagnostic indirect sérologique : nombreuses techniques, dont certaines en recul ++ Remplacé par BM pour le diagnostic des infection aiguës / chroniques Début des années 1980 : mise en place des premières techniques de biologie moléculaireHP pPHUJHQŃH GH O·LQIHŃPLRQ SMU OH 9H+
AVANT: les laboratoires de virologie constituent une partie annexe des laboratoires de microbiologie / bactériologie coursWylie KM et al., Translationnal Research 2013
Virgin HW et al., Cell2009
STRATÉGIES VIRALES / CIRCONSTANCES DIAGNOSTIQUESInfections
gravesInfections
symptomatiques peu gravesInfections a-ou pauci-
symptomatiquesHôte
Polymorphisme
génétiqueHôte
Immunité
VirusVirgin HW et al., Cell2009
35 M350 M
Virgin HW et al., Cell2009
Ce que fait le laboratoire de virologie en pratique hospitalièreOutils : Culture / Sérologie / BM
2.Diagnostic étiologique possible : argument diagnostique
3.Dépistage précoce d䇻une réactivation virale: suivi systématique des
greffés ou des patients sous chimiothérapie anti-cancéreuse ou immunosuppresseurs4.Suivi thérapeutique (efficacité des molécules antivirales et résistance)
5.Réseaux épidémiologiques / surveillance sanitaire (CNR Maladies
Transmissibles) / Indicateurs de Santé Publique6.Détermination d䇻un statut immunitairenaturel ou post-vaccinal
A AJOUTER : CONTEXTE PARTICULIER DES ÉMERGENCES VIRALES BM ++ BM ++ BM ++ BM ++BM ++/ SÉROLOGIE
SÉROLOGIE
Détection des génomes viraux par amplification partielle oDétection qualitative +/-typage / sous-typage oDétection quantitative oDétection moléculaire multiplex Analyse des génomes viraux par séquençage oSéquençage type Sanger oSéquençage nouvelle génération NGSContraintes de la norme ISO15189
en pratique diagnostique DÉTECTION QUALITATIVE OU QUANTITATIVE DES ARN/ADN VIRAUX:ACTIVITÉ AUTOMATISÉE
Extraction des acides nucléiques
Inclusion contrôle interne
PCR en temps réel ++
Nombreuses trousses diagnostiques disponibles
Connection bidirectionnelle au SIL
Bientôt disponibles :
Chaîne automatisée Randomaccess
Actuellement : limitation du travail en série
DÉTECTION EN
DES AGENTS INFECTIEUX
POTENTIELLEMENT
RESPONSABLES
DU SYNDROME CLINIQUE
Absence de technique
de détection "universelle» des virusSymptômes cliniques non
spécifiques :Choix de la cible à détecter ?
pas IMŃLOH"BSHX pertinentBon critères ?
symptômes, âge du patient, immunité, saison ?Choisir ? Pourquoi ?
Influenza A
Influenza A H3
Influenza A H1
Influenza B
Virus Respiratoire SyncytialA
Virus Respiratoire SyncytialB
Metapneumovirus
Parainfluenza1
Parainfluenza2
Parainfluenza3
Parainfluenza4
Rhinovirus / Enterovirus
Coronavirus 229 E
Coronavirus NL63
Coronavirus OC43
Coronavirus HKU1
Adenovirus
Bocavirus
Mycoplasmapneumoniae
Chlamydiae pneumoniae
Bordetellapertussis
LegionellaPneumophyla
Campylobacterjejuni, coli et upsaliensis
Clostridium difficile
Plesiomonasshigelloides
Salmonella
Yersinia enterocolitica
Vibrioparahaemolyticus, vulnificuset cholerae
Vibriocholerae
E. coli EAEC, EPEC, ETEC, STEC
E. Coli O157
E. Coli EIEC
AdenovirusF 40.41
Astrovirus
Norovirus GI/GII
RotavirusA
Sapovirus
Cryptosporidium
Cyclosporacayetanensis
Entamoebahsitolytica
Giardia lamblia
Cytomegalovirus
Enterovirus
Herpes simplex 1
Herpes simplex 2
Herpesvirushumain 6
Parechovirus
Varicelle-zona
JC virus
E. Coli K1
Haemophilus influenza
Listeria monocytogenes
Neisseriameningitidis
Streptoagalactiae
streptopneumoniaeCryptococcusneoformans
AUTOMATES POUR PCR MULTIPLEX (QUALITATIVE)
SAMPLE TO RESULT
Réduction du temps de manipulation (2 mn)
Rendu du résultat en 2H
Coût réactif élevé
Accréditation simplifiée
Limites : importance pour certains panels des codétectionsvirales (coinfections?/ infections séquentielles ?) Étude de la résistance du HIV1 au traitement antirétroviral : séquençage après amplification des gènes cibles des molécules (GP120, protéase, transcriptase inverse, integrase) Étude des résistances des herpesvirusaux antiviraux: HSV1/2, CMVGénotypage des
virus : HIV, hépatiteC, hépatite B,
enterovirus, virusépidémiologiques)
Mise en place en cours ou souhaitée sous forme de plateformes mutualisées dans les CHUIntérêts : outil puissant, plus informatif
1.Séquençage des génomes viraux complets
2.Séquençage en profondeur : études des variantsminoritaires constituant la population
virale infectante (quasispecies)étiologie (diagnostic personnalisé)
4.Intérêts en hygiène hospitalière (infections nosocomiales) et en surveillance sanitaire
Limites actuelles : compétences +++
développement nécessitant des compétences techniques (préparation des échantillons) et
bioinformatiques(traitement et analyse des données) Développement technique très rapide (séquenceurs, trousses de préparation deséchantillons, etc)
MERS-CoV : Coronavirus associé au Syndrome Respiratoire du Moyen-OrientR0 < 1 sauf en milieu de soins
Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë
Mortalité élevée (38%)
MERS-CoV: sous surveillance +++
Emergence 2012 : identification
septembre 2012 Tests diagnostiques moléculaires : dépistage et confirmation. 27 septembre 2012 Corman VM et al, Eurosurveillance 27.09.2012 / Eurosurveillance 06.12.12ORF 1a
ORF 1b
L 5 3HE S NS E M N
Contrôle positif disponible sur plateformes
Laboratoires agréés
par le MERS-CoVen Europe :Capacités de détection
PereyaslovD, EuroSurv2014
EPICOREM. Le Gouil.. 2014
EBOLA : 8 Août 2014
Alerte OMS
internationale1 franchissement de
R0 > 1
Zone urbaine ++
Ebola Virus : génome ARN simple brin polarité négative. FiloviridaeEBOV (Ebola virus Zaïre variant Makona)
oAmpleur exceptionnelle : durée de trois ans o28 652 cas : 11 325 décès, 17 000 survivants o1500 génomes complets générés (NGS) : ~ 5% des patients infectésGP : glycoprotéine
Cytotoxicité / pathogénicité
Liaison au récepteur
Epitopes neutralisants
R0 entre 1,5 et 2,5. Temps de doublement
= 34, 8 jours.Evolution inter -et intra-épidémies ?
Non étudiée auparavant
Nombreuses discussions autour de
de façon inhabituellement rapide lors de cette longue épidémie ?Quick et al., Nature, February 11th 2016
Quick et al., Nature, February 11th 2016
Mise en place du diagnostic moléculaire et de
plateformes de séquençage haut-débit de EBOV avec diversification en plusieurs lignages Saez AM et al, EMBO Mol Med, 2015. Urbanowicz RA et al., 2016UrbanowiczRA et al., 2016
Evolution et adaptation vers un variant
Favorisant la transmission H -to ±H ?
Co circulation de différents lignages GP
Impact sur phénotype in vivo non observé
Variant A82V + efficace
Forme clivée
NCP1 : Niemann-Pick disease, type C1
de EBOV selon les différents auteurs (Génome 19 kb) Les techniques explorant les génomes viraux (biologie moléculaire) constituent actuellement la majorité des techniques utilisée en pratique hospitalière dans les laboratoires de virologie Mise en place des diagnostics infectieux syndromiques Automatisation +++ : diagnostics unitaires, randomaccess Etude des variantsminoritaires par séquençage profond Mutualisation des plateaux techniques infectieux (bactériologie, virologie, parasitologie / mycologie)Contraintes actuelles : nombreuses :
Recrutement des compétences appropriées dans les hôpitaux +++Formation du personnel technique existant
Politique qualité (norme ISO15189)
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