[PDF] TP de Techniques Biochimiques Identification séparation et dosage

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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed Boudiaf-M'sila

Faculté des Sciences

Département de Microbiologie & Biochimie

Polycopié de Travaux Pratiques

TP de Techniques Biochimiques

Polycopié destiné aux Etudiants en 3ième Année Licence en Biochimie

Chargé de TP : Dr. RÉGGAMI Yassine

Année universitaire : 2019-2020

SOMMAIRE

TP n° 0 :

TP n° 1 :

TP n° 2 :

TP n° 3 :

TP n° 4 :

Consignes de sécurité et matériel de laboratoire....................................................

Détermination de la composition générale de différents aliments .................... Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à

l'équilibre en gradient de densité discontinu...........................................................

Détermination de la composition en sucres d'un jus de fruit par Chromatographie sur couche mince (CCM) ............................................................ Identification, séparation et dosage des colorants alimentaires du sirop de menthe. (Chromatographie sur papier / Chromatographie sur colonne /

Spectrophotométrie) ...................................................................................................

1 8 10 14 18

Semestre : 6

Unité d'enseignement Fondamentale 2 (UEM 3.2): Techniques biochimiques et méthodes spectrales

Matière 1: Techniques Biochimiques

Crédits : 8

Coefficient : 3

Objectifs de l'enseignement

Mettre l'accent sur les techniques de fractionnement et les différentes méthodes de séparation

chromatographiques et électrophorétiques ainsi que leurs applications dans le domaine de l'analyse pour l'extraction, l'identification, et la quantification des molécules et plus particulièrement des substances biochimiques.

Connaissances requises recommandées :

Avoir des connaissances en biophysique et en biochimie acquises en L2. Mode d'évaluation : Contrôle continu, Exposés, Posters, Interrogations, Compte rendu de

TP, examen de TD et de TP.

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y

TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire

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TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire

1. Consignes de sécurité

Par mesure d'hygiène, il est interdit de manger dans le laboratoire. Le port de la blouse 100% coton est obligatoire. La blouse doit être de longueur raisonnable et à manches longues. Les étudiants doivent toujours manipuler debout. Aucun objet ne doit encombrer les paillasses. Les tabourets ou les chaises doivent être rangés sous les paillasses afin de ne pas encombrer les allées. Pour chaque manipulation présentant un risque, le port des lunettes de protection et de

gants en latex est impératif. Les cheveux longs doivent être attachés derrière la tête.

Toute manipulation de produits chimiques présentant un risque doit être réalisée sous une

hotte ventilée, avec vitres protectrices. Le pipetage à la bouche est interdit. Utiliser les propipettes. IL est interdit de regarder de près les récipients contenant des liquides en ébullition. Ne pas respirer le contenu d'un récipient pour l'identifier à son odeur. Reboucher tout flacon immédiatement après usage. Ne jamais prendre de produits solides avec les doigts, utiliser une spatule. Utiliser des verreries résistantes aux hautes températures (verrerie Pyrex) lorsqu'il faut chauffer. Éviter de faire subir des chocs thermiques à la verrerie (ne pas refroidir brutalement un récipient chaud).

Les paillasses doivent être nettoyées au cours de la séance et laissées parfaitement propres et

sèches en fin de séance.

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TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire

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Il est impératif de se laver soigneusement les mains après manipulation.

Il est recommandé de ne jamais jeter dans les éviers de laboratoires, les produits à risque :

Verser les solutions dans les flacons de récupération prévus à cet effet. Les pictogrammes de sécurité de produits chimiques doivent être connus.

Le SGH (ou en Europe " règlement CLP ») s'applique de façon obligatoire aux substances depuis fin 2010. Ce nouveau système comprend 9 pictogrammes. Baptisé " Système Général Harmonisé (SGH) » ou " Globally Harmonized System (GHS) », il a pour but d'uniformiser l'étiquetage des produits chimiques à l'échelle mondiale. Il est appliqué en Europe sous le nom de " Règlement CLP ». Le

système européen préexistant et le nouveau système SGH cohabitent ainsi depuis le 1 er décembre 2010.

2. Connaissance des risques de produits utilisés

Il existe trois grandes catégories de dangers intrinsèques aux substances chimiques : les dangers physiques (risque d'explosion, d'inŇammation, etc.) ;

les dangers pour la santé (toxicité aiguë, lésion oculaire, toxicité pour la reproduction, etc.) ;

les dangers pour l'environnement (danger pour les milieux aquatiques).

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TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire

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TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire

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3. Etiquetage de produits chimiques

La première information sur les dangers d'une substance chimique est fournie par l'étiquette sur

laquelle doit apparaître au moins : le nom du produit ; des pictogrammes de danger ; des mentions de dangers (phrases H) ; des conseils de prudence (phrases P) ; une mention d'avertissement. Sur l'étiquette, peuvent aussi figurer des grandeurs physiques (densité, masse molaire, composition, etc.). L'image suivante donne l'exemple d'une étiquette d'acide chlorhydrique concentré.

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Pictogrammes de danger

Ces schémas représentent des types de dangers particuliers. Ils sont notés SGHXX et sont présentés dans la figure suivante.

Mentions de danger (phrases H)

Les mentions de danger complètent les pictogrammes. Elles commencent toujours par la lettre H (pour Hazard = danger) qui est suivie d'un nombre à 3 chiffres. Le 1er chiffre correspond à la catégorie de danger. H2XX : mentions de dangers relatives aux dangers physiques ; H3XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour la santé ; H4XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour l'environnement.

Conseils de prudence (phrases P)

Les conseils de prudence complètent également les pictogrammes. Ils commencent toujours par la lettre P (pour Prudence) qui est suivie d'un nombre à 3 chiffres. Le 1er chiffre correspond à la catégorie de conseil de prudence.

P1XX : conseils de prudence généraux ;

P2XX : conseils de prudence - Prévention ;

P3XX : conseils de prudence - Intervention ;

P4XX : conseils de prudence - Stockage ;

P5XX : conseils de prudence - Élimination.

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Mention d'avertissement

Sur l'étiquette figure une mention d'avertissement " Attention » ou " Danger » qui indique le

degré relatif de dangerosité. " Danger » est utilisé pour les dangers les plus graves. Substances C.M.R. : Cancérogène, Mutagène, toxique pour la Reproduction Il existe une classification européenne de produits chimiques C.M.R. qui s'appuie sur des

résultats d'études animales et/ou humaines. La liste des substances C.M.R. évolue car tous les

produits n'ont pas été testés.Les composés C.M.R. doivent être stockés sous clé et utilisés en

respectant scrupuleusement les consignes de sécurité. Quelques exemples de substances C.M.R. : aniline, benzène, 1,3-butadiène, chlorure de cobalt (II), dichromate de potassium, mercure, phénol...

4. Premiers soins aux victimes d'accident

4.1. En cas de projection cutanée

Rincer la peau longuement et abondamment à l'eau claire jusqu'à ce que le produit soit

éliminé.

Attention, ne pas chercher à neutraliser les produits acides ou basiques.

4.2. En cas de projection oculaire

Rincer immédiatement et abondamment à l'eau froide.

Consulter systématiquement un ophtalmologue.

4.3. En cas d'ingestion accidentelle

En cas d'ingestion, rincer la bouche. Boire un verre d'eau. En cas d'inhalation de vapeurs (Eau de Javel, Brome...), amener la personne dans un endroit aéré.

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5. Verreries et Petit Matériel de Laboratoire

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TP n 1 : Détermination de la composition générale de différents aliments

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TP n° 01 : Détermination de la composition générale de différents

aliments Cette manipulation sera effectuée sur 4 aliments : pain, viande, produit laitier, fruit.

1. Détermination de la teneur en eau

1.1. Définitions

Teneur en eau : c'est la quantité d'eau exprimée en pourcentage contenue dans un composé solide ou liquide.

Matières sèches (ou extrait sec) : il s'agit du produit résultant de la déshydratation (élimination de

l'eau) d'un composé solide ou liquide. On l'exprime en g /10 pour un produit solide.

1.2. Mode opératoire

-Peser un creuset en silice vide : masse m1 -Déposer le produit à analyser et peser le creuset plein : masse m2 -Placer le creuset à l'étuve à 100-110°C pendant 1 heure. -Laisser refroidir au dessiccateur (préserve le produit déshydraté de l'humidité). -Peser après déshydratation le creuset : masse m2'.

1.3. Résultats

m

2 - m1 = correspond à la masse .........................

m

2' - m1 = correspond à la masse ..........................

m

2 - m2' = correspond à la masse .........................

Etablir les formules permettant de calculer la teneur en eau et le pourcentage de matières sèches du produit à analyser.

2. Détermination de la teneur en minéraux et en matières organiques

2.1. Principe

La matière sèche obtenue après déshydratation d'un produit est composée de substances minérales (calcium, magnésium, chlorures...), mais aussi de substances organiques (glucides,

lipides, protides, acides nucléiques). Il s'agit de molécules complexes constituées majoritairement

des éléments C, H, O et N.

Un chauffage puissant au four à moufle à 500°C permet la destruction et l'élimination totale

des matières organiques qui se trouvent totalement dégradées en matières minérales qui

s'échappent du creuset sous forme gazeuse, c'est la minéralisation : Matières organiques CO

2 + H2O + NH3

Il reste alors dans le creuset les sels minéraux sous forme de cendres blanches.

2.2. Mode opératoire

-Placer le creuset contenant la matière sèche au four à moufle à 500-600°C pendant 2 heures.

-Refroidir au dessiccateur. -Peser le creuset contenant les cendres : masse m3

2.3. Résultats

m

3 - m1 = correspond à la masse ..................................

m

2' - m3 = correspond à la masse ..................................

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TP n 1 : Détermination de la composition générale de différents aliments

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Etablir les formules permettant de calculer :

-le pourcentage de matières minérales dans la matière sèche (en g dans 10 de matière sèche).

-le pourcentage de matières organiques dans la matière sèche (en g dans 10 de matière sèche).

-le pourcentage de matières minérales dans le produit frais. -le pourcentage de matières organiques dans le produit frais. Récapituler tous les résultats dans le tableau suivant :

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TP n° 02 : Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à l'équilibre en gradient de densité discontinu.

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TP n° 02 : Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à l'équilibre en gradient de densité discontinu.

1. Introduction :

La centrifugation est une méthode couramment utilisée en biochimie pour séparer ou analyser des fractions ou des structures cellulaires, des cellules entières, des macromolécules, etc. On peut accentuer ou raffiner la séparation entre les particules en faisant cette centrifugation dans un gradient de concentration. En effet, un des facteurs qui influence la vitesse de sédimentation est la différence entre la densité de la particule et celle du solvant. On peut donc moduler cette vitesse en faisant

varier de façon continue ou par étape (discontinue) cette différence de densité en créant un

gradient de densité : Si la densité de la particule est plus grande que celle du solvant, elle sédimentera. Plus la différence de densité est grande plus la sédimentation est rapide. S'il n'y a aucune différence de densité, il n'y aura aucune sédimentation, quelle que soit l'accélération. Si la particule est moins dense que le solvant, celle-ci s'élèvera dans le tube jusqu'à

atteindre un niveau de densité égal à la sienne ou, le cas échéant, jusqu'à flotter à la

surface.

2. Principes de la technique :

2.1. Fabrication des gradients :

Les variations de densités sont obtenues en faisant varier la concentration d'un produit chimique dans la solution. Divers produits peuvent être utilisés pour faire ces gradients. Ils doivent être très solubles en solution aqueuse, ce qui permet d'obtenir des densités suffisantes. On recherche aussi des produits qui sont relativement inertes, peu coûteux, faciles à manipuler, non toxiques, etc. Évidemment aucun produit ne réunit toutes ces qualités et on doit choisir en tenant compte des contraintes expérimentales. Le saccharose ("sucrose") est très souvent employé. Il permet d'atteindre des densités

assez élevées, de l'ordre de 1.3 g/mL avec du saccharose 2.5 M. Ce produit a l'avantage d'être

peu coûteux, électriquement neutre et plutôt inerte pour la plupart des fractions cellulaires.

Son principal défaut est sa viscosité à forte concentration, ce qui rend son utilisation plus

difficile. Il est aussi à déconseiller si la pression osmotique est un facteur important, par exemple dans l'isolement de cellules entières.

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TP n° 02 : Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à l'équilibre en gradient de densité discontinu.

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Un autre produit couramment utilisé, particulièrement dans la séparation des acides

nucléiques, est le chlorure de césium (CsCl). Ce sel peut atteindre une densité très élevée, de

l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5 mol/L. Cette possibilité d'atteindre des densités si élevées en

solution aqueuse est son principal avantage. Son coût et le fait qu'il s'agisse d'un sel, donc de

molécules chargées, réduisent son champ d'application. D'autres sels de césium peuvent aussi

être employés comme le CsSO

4. D'autres produits peuvent aussi être utilisés pour séparer des cellules ou des organites par gradient de densité. Cependant, ils sont souvent restreints à des applications particulières. Leur coût peut aussi être prohibitif.

2.2. Gradients continus et discontinus :

Figure 1A : Exemple de gradient discontinu. On peut facilement fabriquer un gradient de densité discontinu en déposant une sur l'autre 2, 3 ou 4 couche (cas présenté) de solutions de saccharose de diverses concentrations.

L'échantillon a été représenté au

sommet ce qui suppose qu'il soit moins dense que la première couche de solution de saccharose. Il arrive qu'on place l'échantillon au fond, au besoin en ayant au préalable augmenté sa densité en ajoutant du saccharose (par exemple). Figure 1B : Exemple de gradient continu. On peut aussi obtenir un gradient continu où la variation de densité est graduelle le long du tube à centrifuger. On le coule en faisant varier en continu le débit de deux pompes qui mélangent deux solutions, l'une à 10% et l'autre à 60% de saccharose dans le cas présent. Le gradient peut être linéaire (cas présenté) mais aussi exponentiel ou logarithmique selon les besoins.

3. Objectifs :

Réalisation d'un gradient de densité discontinu en utilisant des solutions de saccharose de concentrations décroissantes : 60%, 40%, 25% et 10%.

Séparation de plastes cellulaires (lycopènes de tomate, carotènes de la carotte et chloroplastes

des feuillets de laitue).

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TP n° 02 : Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à l'équilibre en gradient de densité discontinu.

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4. Produits et Materiel :

4.1. Produits utilisés : 3 échantillons (feuillet de laitue, carotte et tomate). Saccharose : 14 Eau distillée: 2 L

4.2. Matériel : Centrifugeuse + Tubes à centrifuger. Balance de précision + Spatule + Capsule de pesée.

1 Fiole de 100 ml 4 Bêcher de 100ml. Agitateur magnétique + barreau aimanté. 3 Mortier et pilon. 3 Compresse (gaze). Entonnoir + Pipettes 2 ml + pipeteur. 3 Bêcher de 50ml. Agitateur de tubes (vortex).

5. Mode opératoire :

5.1. Préparation des solutions de saccharose 60%, 40%, 25%, 10% et 3% :

Pour préparer une solution de saccharose 60% ; on pèse, à l'aide d'une balance de précision tarée, de saccharose (sucre alimentaire). Par la suite, on rempli la fiole de

100 ml contenant ce saccharose par l'eau distillé jusqu'au trait de jauge. Enfin, on fait

dissoudre le saccharose dans un bécher de 100 ml, à l'aide d'un agitateur magnétique. On procède de la même manière avec les autres concentrations (40g de saccharose pour la solution de 40 %, pour 25%, pour 10% et pour 3%).

5.2. Préparation des jus :

On découpe les échantillons (feuillet de laitue, carotte et tomate) chacun dans un mortier en broyant à sec puis on ajoute quelques millilitres de saccharose 3% (dilué) pour permettre l'éclatement des cellules et donc libération des organites dont les plastes. (Extraction par osmose).

On filtre à l'aide d'une compresse (gaze) et on récupère les jus chacun dans un bécher de

50 ml.

5.3. Centrifugation préparative :

Cette première centrifugation permet de récupérer les plastes dans le culot. Pour ce faire, on utilise une centrifugeuse oblique. Dans un premier temps, on équilibre la centrifugeuse de telle façon que chaque 2 tubes opposés auront le même poids. On ferme bien l'appareil sans oublier d'y programmer (le temps de rotation ainsi que la vitesse par Rotation Par Minute " rpm » propre pour chaque appareil ou par Force Centrifuge Relative RCF en " g » c'est une unité fondamentale). Enfin, on lance la centrifugeuse en appuyant sur START. (6000 rpm pendant 5 min).

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TP n° 02 : Séparation de plastes cellulaires par la technique de centrifugation à l'équilibre en gradient de densité discontinu.

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Après centrifugation, on obtient pour chaque tube : un culot et un surnageant. On élimine le surnageant et on récupère le culot contenant les organites cellulaires dont les plastes.

5.4. Réalisation d'un gradient discontinu décroissant de saccharose :

Le gradient discontinu est décroissant 60%, 40%, 25%, et 10% ceci est obligatoire car dans le cas inverse, les molécules possédant une densité faible (diamètre important) ne peuvent pas traverser la couche la plus concentré pour atteindre leur position. Dans un premier temps, on verse 2 ml de saccharose 60% dans un tube de centrifugation, sur lequel on rajoute délicatement et progressivement (la position du tube est oblique dans ce cas) 2 ml de saccharose 40% pour que les 2 concentrations soient séparer. Il est important de signaler que l'ajout se fait goutte à goutte sur la paroi du tube. On procède de la même manière pour le saccharose 25% et 10%. On obtient un gradient discontinu car présentant une différence suffisante de densité entre les couches superposées

5.5. Centrifugation analytique :

On ajoute 2 ml de saccharose 3% pour chaque culot puis on homogénéise en utilisant un vortex (on utilise dans ce cas le saccharose 3 % qui est de faible concentration inférieur à celle de la première couche du gradient permettant le dépôt). On dépose chacun sur un gradient, 1 ml de chaque échantillon (progressivement et délicatement contre les parois).

Enfin, on centrifuge (2000 rpm pendant 10 min).

6. Résultats :

Interpréter les résultats obtenus.

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TP n° 03: Détermination de la composition en sucres d'un jus de fruit par Chromatographie sur couche mince (CCM)

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TP n° 03: Détermination de la composition en sucres d'un jus de fruit par

Chromatographie sur couche mince (CCM)

1. Introduction

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique d'analyse qualitative. Elle a

pour but de séparer les produits d'un mélange et permet d'identifier un composé, de vérifier sa

pureté ou de suivre l'avancement d'une réaction en analysant des prélèvements successifs du

milieu réactionnel afin de mettre en évidence l'apparition de produits et/ou la disparition de réactifs.

2. Objectif du TP

Déterminer la composition en sucres d'un jus de fruit par Chromatographie sur couche mince (CCM).

3. Principe de la technique

Considérons un mélange de composés que l'on souhaite séparer. Lors d'une CCM, le mélange

est déposé sur un solide poreux adsorbant appelé phase stationnaire qui recouvre une plaque rigide inerte. La partie inférieure de cette plaque est mise en contact avec un solvant appelé phase mobile qui monte par capillarité : on parle d'élution et la phase mobile est appelée éluant. Figure 1 : Dispositif simple d'une CCM. À gauche : schéma d'une plaque CCM sur laquelle ont été déposés deux

échantillons (taches A et B) ; la tache du

centre (A+B) correspond au co-dépôt des échantillons A et B.

À droite : schéma d'une plaque CCM

placée dans une cuve à élution fermée. Lors de l'élution, les différents composés du mélange migrent plus ou moins haut sur la plaque du fait de la compétition entre trois phénomènes : o l'adsorption des composés sur la phase stationnaire ; o la solubilisation des composés dans l'éluant ; o l'adsorption de l'éluant sur la phase stationnaire (qui remplace les composés adsorbés sur la phase stationnaire et les " pousse» alors vers le haut). Figure 2 : Interactions existant entre le composé et les phases mobile et stationnaire.

Matière: Techniques Biochimiques Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y

TP n° 03: Détermination de la composition en sucres d'un jus de fruit par Chromatographie sur couche mince (CCM)

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Ces trois phénomènes sont gouvernés par des interactions faibles de type interactions de Van der

Waals et liaisons hydrogène. Pour optimiser la séparation entre les trois acteurs (composé, adsorbant, éluant), il faut prendre en compte :

- leur polarité (fonction de différents paramètres tels que le moment di-polaire, la permittivité

diélectrique...) ; - leur proticité (aptitude à établir des liaisons hydrogène).

Phase stationnaire (adsorbant)

Elle est le plus souvent constituée de silice SiO2, déposée sur un support rigide en verre, en

aluminium ou en plastique.

Chaque grain de silice présente en surface des groupements silanols Si-OH : c'est donc un matériau

polaire et protique. Figure 3 : Vision schématique de la surface d'un grain de silice. L'interaction avec un alcool est plus forte qu'avec un aldéhyde (plus grand nombre de liaisons

hydrogène établies) : à éluant égal, l'alcool est plus retenu par la phase stationnaire que l'aldéhyde.

N.B : La silice a un caractère acide gênant si les échantillons à analyser sont dégradables en milieu

acide. On peut lui substituer d'autres phases stationnaires polaires et protiques telle que l'alumine

Al

2O3. Celle-ci peut être traitée de façon à avoir un caractère acide, neutre ou basique que l'on

choisira en fonction des composés à analyser.

Phase mobile (éluant)

Un éluant est caractérisé par sa polarité et sa proticité. Il n'est pas toujours aisé de comparer la

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