[PDF] La Chromatographie en Phase Liquide CPL

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La Chromatographie La Chromatographie

en Phase Liquideen Phase Liquide

CPLCPL

MariePaule Bassez

http://chemphys.ustrasbg.fr/mpb PLAN

Introduction

1. Chromatographie de partage: en mode normal;en mode inversé;Phases stationnaires

2. Chromatographie d'adsorption

Les solvants

3. Chromatographie d'exclusion st

érique4. Chromatographie ionique ou par

échange d'ions5. Chromatographie d'affinit

é6. Chromatographie liquide chirale

7. Electrochromatographie capillaire

7.1 Introduction

7.2 Flux

électroosmotique7.3 Electrochromatographie sur colonne capillaire remplie et nonremplie

7.4 Chromatographie

électrocinétique micellaire capillaire

8. L' instrumentation

8.1 Réservoirs8.2 Pompes

8.3 Injecteurs d'

échantillon 8.4 Colonnes

8.5 D

étecteurs9. Chromatographie planaire

9.1 Introduction

9.2 D

épôt de l'échantillon9.3 D

éveloppement de la plaque9.4 D

étection 9.5 Chromatographie bidimensionnelle

9.6 Phases stationnaires

9.7 Grandeurs Chromatographiques

Bibliographie

Tableau 1. Les différentes techniques chromatographiques Phase Mobile PS

2 3 4 5 1 Introduction

liq (LLC) P. organ. polaire/apol. (LPgreff

ée)partage

(LLC)

LPgreff

éeLC, CPLSFC, CPSGC, CPG

67 d'apr

ès C. Poole 2003, p5 et http://web.uconn.edu/rusling/Stuart_intro.pdf gel partage (ECC)

Les techniques chromatographiques peuvent être classées selon le type de phase stationnaire et mobile.

Que la PM soit gazeuse, liquide ou supercritique, la PS est situ

ée dans une colonne, travers

ée par la PM sous l'effet d'une pression extérieure. C'est la:chromatographie sur colonne column chromatography. La chromatographie liquide moderne utilise beaucoup d'oxydes inorganiques avec groupements fonctionnels organiques chimiquement li

és: "bonded phases" ainsi que des polym

ères poreux.

Quand la PS est

étalée en fine couche sur une surface plane telle une plaque de verre (auparavant du papier) et que la PM se d

éplace sur cette couche sous l'effet de forces de capillarit é, la technique est appelée:chromatographie planaire ou sur couche mince planar or thinlayer chromatography (TLC) En considérant la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les mol

écules de soluté, les séparations chromatographiques sont classées en 5 principaux types:

1. Chromatographie de partage en phase normale ou invers

ée2. Chromatographie d'adsorption

3. Chromatographie d'exclusion st

érique 4. Chromatographie sur

échangeur d'ions5. Chromatographie d'affinit

é6. Electrochromatographie

Rem. L'efficacit

é d'une colonne augmente quand la taille des particules de support diminue et donc que la hauteur

équivalente à un plateau théorique diminue. Pour obtenir un d

ébit convenable avec des microparticules de 2 à 5 μm de diamètre, il faut exercer une forte pression sur la phase mobile. La CLHP, Chromatographie Liquide

à Haute Performance a donc

été longtemps appelée Chromatographie Liquide sous Haute Pression. Depuis 2004, l'UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography, avec PS de particules < 2 μm (cf. "Notions fondamentales de chromatographie".

Les techniques chromatographiques (cf. tableau 1)

1. PS = film liquide imprégné sur un support solide (silice) ou phase organique greffée par liaison covalente et le M

chromatographie de partage ou chromatographie liquideliquide (LLC), * si la PM est plus polaire que la PS: chromatographie en mode invers

é reversedphase chromatography (RPC)

2. PS = solide et MS = adsorption en surface de la PS:

chromatographie d'adsorption, (LSC)

3. PS = solide avec pores uniformes et MS= la s

éparation des solutés selon leur taille:chromatographie d'exclusion st

érique: sizeexclusion chromatography: (SEC)

4. PS = solide avec des sites ioniques et MS= interaction

électrostatique entre les ions de PM et les ions de PS: chromatographie ionique, ionexchange chrom. (IEC) or ionchrom. (IC)

5. PS = solide avec ion m

chromatographie d'affinit é sur ions métalliques immobilisés, affinity chromatogr. (AC)

6. MS= entra

lectrochromatographie capillaire, ECC, capillary electrochromatography (CEC)

7. PS = micelles charg

électrocinétique micellaire capillaire, CEMC, micellar electrokinetic chromatography (MEKC)

1. Chromatographie de partageLe mécanisme de séparation est le partage entre la PM et la PS. La PS peut être un film liquide impr

égné sur un support (silice) mais il a tendance à être emport

é avec la PM ("lessivage", "bleeding"), ou une phase organique fixée par liaison covalente sur un support (gel de silice) (phase greff

ée). On distingue deux types de chromatographie de partage selon les polarit

és relatives des phases mobile et stationnaire:Chromatographie à polarité de phase normaleChromatographie à polarité de phase normale

(mode normal ou direct): La phase stationnaire est polaire, de nature hydrophile, avec des groupements: amine: NH2 , nitrile: CN, dialcool ou diol: (CHOH)CH2OH, greff és sur la silice.La phase mobile est un solvant apolaire, de nature lipophile : l'hexane ou l' éther ipropylique (isopropylique) ((CH3)2CHOCH(CH3)2).

Le solut

é le moins polaire est élué en premier. (rem: alkyles: C8: (CH2)7CH3 et C18: (CH2)17CH3 , apolaires; ph

ényle: (CH2)nC6H5 apolaire)

Chromatographie à polarité de phase inverséeChromatographie à polarité de phase inversée

(reversed phase, mode inversé)c'est la phase stationnaire, constitu ée souvent d'un hydrocarbure qui est apolaire, de nature lipophile, avec des cha

înes alkyles de C4 à C30 , des

groupements propyle, ph ényle, diphényle. La phase mobile est un solvant polaire, tel l'eau, le m

éthanol, ou le cyanure de m

éthyle (acétonitrile). Les colonnes C18 sont remplies de silice greff

ée en phase inverse C18 ,

ou "gel de silice C18" : SiOSi(CH3)2(CH2)17 CH3 ; les colonnes C4 sont utilis ées pour séparer les peptides et les protéines, les C30 pour les carot

énoïdes et les flavanoïdes.

Le gel de siliceLe gel de silice

C'est un solide amorphe, un polymère inorganique de formule SiO2(H2O)n avec n proche de 0, la silice naturelle cristalline

étantde formule: SiO2.. La structure

est de type t étraédrique avec groupements silanol: SiOH. Il est sous forme de: microsph ères de diamètre ~constant dans une même colonne (d = 112 μm). monolithe poreux: gel de silice d'une seule pi

èce dans la colonne. Il est tr

ès polaire. Avec un éluant apolaire, les solutés polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux solut

és apolaires qui sortent en premier. Le m

écanisme d'action du gel de silice repose sur l'adsorption. Avec les particules de faible diam ètre, d ~ 2 μm, la surface de contact ,la HEPT et l'efficacit é de la colonne . (cf Notions fondamentales)  Synthèse du gel de siliceSynthèse du gel de silicetetra

éthoxysilaneTEOS, Si(OEt)4,

t

étraédrique(ou TMOS

t par condensation, il y a formation d'une liaison siloxane, et par polycondensation, d'un r éseau tridimensionnel de tétraèdres SiO4. Un tétraèdre est li é à d'autres. Il existe donc une formule chimique "moyenne" SiO2 . C'est une structure t

étraèdrique de type SiO4 mais avec fonctions silanol. Par séchage, la taille des particules diminue. Il y a formation de microsph

ères poreuses.http://fr.wikipedia.org/wiki/Proc%C3%A9d%C3%A9_solgel F.Chaput

Fig. particule de gel de silice

Ref: H.HBauer, G.D.Christian, J.E.O'Reilly, Instrumental Analysis, 1978, Allyn and Bacon, p657 et http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC3.pdfGroupements silanol associés par liaison hydrog

èneFonctions silanolPont siloxane

Liaison hydrog

èneDes mol

écules d'eau peuvent se fixer par liaison hydrog

ène pour former un gel + ou hydrat

éOHOH2

pore microsph

ère poreuse sph

ères submicroniques

Si-OH : fonction silanol

Si O : groupement diméthylsiloxane

(de silicium, oxygène et alcane)Si - O - Si: pont ou liaison siloxane

SiH4 : silane (cf. CH4 méthane)

CH3 CH3 M ic r o p o r e u x d 2 n mM e s o p o r e u x 2 d 5 0 n mM a c r o p o r e u x d 5 0 n mL e s s o l i d e s p o r e u xzé ol it h esM C Mm o u ss e V O Ref: http://www.labos.upmc.fr/lcmcp/files/livage/Cours%20200506/51Microporeux.ppt

Compléments: Les monolithes siliciques http://www.lof.cnrs.fr/article.php3?id_article=255normes UIPCA

silice mésostructurée type hexagonalLes solides poreux mésoporeux dpore < 2 nmmicroporeux

2 dpore>50nm zéolithesmousse V2O5

Fig. Photographies de gels de silice obtenues par

microscopie électronique à balayage.a) Les particules sont homog

ènes; la porosité est de 50% et le diam

ètre des pores est de 10nm; la surface de contact (surface sp

écifique) est de 150 m2/g. (porosit

é=Volume vide/ Vtotal)b) Le x

érogel a une porosité de 70%; sa surface de contact est de 300 m2/g et ses pores ont un diam ètre de 10nm.Rem. Pour les colonnes monolithiques, la porosit é peut atteindre 90% du volume total de la colonne.

Ref. Kirkland 1996; K.Unger 1979 et site ;

ef. http://diffusiondessavoirs.uomlr.fr/balado/wpcontent/uploads/2008/01/chromatoliquide2007.pdfLe gel de silice comporte des pores de diff

érentes dimensions.

Fig. a) Photographie par microscope électronique à balayage MEB (Scanning Electron Microscope, SEM image) d'un monolithe poreux de gel de silice. Le diam

ètre moyen des pores est de 14,2 nm et la surface sp

écifique de 105,3 m2/g.

b) S

éparation d'acides organiques avec ce monolithe par électrochromatographie capillaire, ECC (capillary electrochromatography, CEC). L'efficacit

é de la colonne correspond

à 267 000 plateaux/m. PM: 10 mM citrate avec 40% acétonitrile; séparation à 10 kV. Ref. E.Grushka p.404 et site

Les phases stationnaires grefféesLes phases stationnaires greffées Le gel de silice est hydrophile. Ses caractéristiques évoluent dans le temps, ce qui conduit

à un manque de reproductibilité. Pour diminuer sa polarité, il est rendu hydrophobe par fixation par liaison chimique de mol

écules organiques sur les fonctions silanol. Le gel de silice devient alors un support de la phase

stationnaire. L'oxyde de zirconium ZrO2 , l'oxyde de titane TiO2 ou l'alumine Al2O3 peuvent remplacer le gel de silice en qualit

é de support. La s

éparation met alors en jeu des coefficients de partage et non des coefficients d'adsorption. Ces phases greff

ées dont la polarité est ajustable, sont utilis ées dans la: chromatographie liquidephase greff

ée .

La plupart des supports à phase greffée sont constitués de siloxanes: Si OH + Cl SiR(CH3)2 SiO Si R(CH →3)2 + HCl silanol organochlorosilane siloxane dim

éthylchlorosilane r

éaction de silanisation

Si R = groupement alkyle ou greffon alkyle en C8 (noctyle): - (CH2)7 CH3 ou en C18 (noctad écyle): - (CH2)17 CH3 la phase greffée est apolaire.

La diff

érence d'électronégativité entre C et H est faible. P(C)=2,5 et P(H)=2,2.

Plus la cha

îne est longue, plus le soluté est retenu et plus tR ↑. La PM (solvant) est polaire: m

éthanol, eau. Les solutés polaires sont élués en 1er. D'autres types de greffons peuvent

être greffés sur du gel de silice: des porteurs de fonctions aminopropyle, cyanopropyle... ou des greffons dipolaires.

La polarit

é de la phase greffée augmente.

OSiCH3

CH3unit

é de base du diméthylsiloxane

Ref. C.Poole,The Essence of Chromat., Elsevier 2003, p285. http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC3.pdfFig. Groupements fonctionnels R des organosiloxanes greffés. greffon

propyl propyl CH3

CH3 Si O Si (CH2)17 CH3noctad

écyle dim

éthylsiloxane

Ref. LCGC Asia, 8 (1), 2005

2. Chromatographie d'adsorption ou liquide-solide Il existe un mécanisme d'adsorption du soluté par la phase stationnaire solide et un m

écanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide ou gazeuse. La 1

ère séparation chromatographique était de ce type: séparation de pigments végétaux sur de la craie (carbonate de calcium) par Tswett en 1906.

Dans le processus d'adsorption sur une surface, les liaisons sont de faible nergie: liaisons hydrogène, dipôledipôle ou de van der Waals.quotesdbs_dbs29.pdfusesText_35

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