[PDF] Diapositive 1 30 janv. 2021 Méthodes

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30/01/2021

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UniǀersitĠ d'Alger 1 Banyoucef

Benkhedda

Faculté des Sciences

Département SNV

2ème année SNV (S3)

Module: Biochimie

Année universitaire: 2020/2021

MĠthodes d'analyse et de sĠparation des peptides et protéines MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗ BUT

YLe but des techniques de séparation et

quantification des protéines : YCes méthode sont utilisées en recherche pour cibles thérapeutiques YMais également en analyse biologique de routine pour la recherche de paramètres perturbés chez les patients.

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Méthodes de séparation des protéines :

MĠthodes d'analyse et de sĠparation des

peptides-protéines

Electrophorèse:

¾Dans des conditions non dénaturantes

¾Dans des conditions dénaturantes

Méthodes Chromatographique

¾-Chromatographie d'edžclusion molĠculaire

¾-Chromatographie échangueses d'ions

¾-chromatographie d'affinitĠ

Combinaisons de séparation identification et quantification des protéines MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

I- Chromatographie

La chromatographie est une technique de séparation des constituants d'un mélange dans laquelle interviennent des phénomènes d'adsorption et de partage. Le mécanisme général correspond à l'entraînement de ces constituants par une phase mobile (liquide) le long d'une phase stationnaire ou fixe (solide, gel de silice sur plaque aluminium par exemple) contenue dans une colonne. Le solvant de chromatographie de la phase mobile déposé en haut de colonne va descendre par capillarité dans la phase stationnaire entraînant avec lui les composants protéiques. Selon leur hydrophilie, pHi ou encore selon leur P.M ils migreront plus ou moins vite dans la phase fixe.

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3 Les techniques de chromatographie permettent la séparation des molécules en fonction de leurs propriétés physicochimiques : ¾La chromatographie d'edžclusion moléculaire (filtration sur gel) sépare en fonction de la taille. ¾La chromatographie échangeuse d'ions sépare en fonction de la charge. ¾La chromatographie d'affinité sépare en fonction de la structure/ séquence.

Méthodes de séparation des protéines :

Lors de la chromatographie d'edžclusion moléculaire, les molécules sont séparées de la plus grande à la plus petite en fonction de leur taille moléculaire en solution. Les molécules de très grande taille sont exclues en premier de la phase stationnaire. Les molécules de plus petite taille pénètrent dans les pores à des degrés divers en fonction de leur taille. Les molécules les plus petites diffusant le plus en profondeur dans la structure des pores et sont éluées en dernier. MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗ I-1- La chromatographie d'edžclusion molĠculaire (gel filtration)

Une bille de la phase stationnaire

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4 Dans une chromatographie échangeuse d'ions, des groupes fonctionnels capables de se dissocier sont fixés à la résine. Ce sont habituellement des groupes sulfonate (SO3-: échange de cation) ou ammonium quaternaire (-N (R)3+: échange d'anions). Avec une résine échangeuse d'anions , les molécules chargées négativement restent fixées sur les billes, et les molécules chargées positivement sont éluées. Avec une résine échangeuse de cations, c'est le contraire. MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗ I-2-La chromatographie Ġchangeuse d'ions (cf. Acides aminĠs) MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

I-2-La chromatographie Ġchangeuse d'ions

I-2-1-La chromatographie échangeuse de cations

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5 MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

I-2-La chromatographie Ġchangeuse d'ions

I-2-2-La chromatographie Ġchangeuse d'anions

MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

I-2-La chromatographie Ġchangeuse d'ions

Choix du type d'échangeur d'ions en fonction du pI de la protéine à séparer et du pH du tampon

Considérons une protéine de pI = 5 :

si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pI de la protéine (zone bleue), celle-ci est chargée positivement ; il faut utiliser un échangeur de cations ; si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pI de la protéine (zone rouge), celle-ci est chargée négativement ; il faut utiliser un échangeur d'anions.

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6 Lors de la chromatographie un ligand ayant la propriété de fixer spécifiquement une molécule ou un groupe de molécule est lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi au moment du chargement de la colonne, les composés qui ont une affinité pour le ligand sont fixés alors que les impuretés sont éliminées. Par la suite, les composés sont élués avec un solvant dont les caractéristiques chimiques favorisent leur dissociation avec le ligand . MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

I-3-La chromatographie d'affinitĠ

L'Ġlectrophorğse permet de séparer des solutés chargés par migration dans un champs électrique. La migration dépend de la charge de la molécule, de sa taille et -Electrophorèse en condition non dénaturante -Electrophorèse en condition dénaturante MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

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Méthodes de séparation des protéines :

II-L'Ġlectrophorğse

II-1. L'électrophorèse en conditions non dénaturantes les molécules sont séparées dans leur état natif. Plus la charge est importante, plus la vitesse de migration sera importante. selon le signe de la charge native, les molécules pourront migrer vers l'anode (molécules chargées négativement) ou vers la cathode (molécules chargées positivement).

et que pour les protéines il convient donc de faire le dépôt à mi-chemin des deux électrodes.

les protéines conservent leur structure "native" (structure tertiaire, quaternaire). Elles conservent donc a priori leur activité, qui pourra être révélée dans le gel. MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

II-1. L'électrophorèse en conditions non dénaturantes

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8 II-2. L'électrophorèse en conditions dénaturantes MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

Les molécules sont soumises à un traitement dénaturant préalablement à leur

séparation électrophorétique, détruisant la structure tridimensionnelle native. Il existe

différentes méthodes pour dénaturer les molécules. Plusieurs conditions peuvent causer la dénaturation des protéines :

Chaleur

pH : l'acidité ou l'alcalinité extrême Solvant : le changement du solvant peut modifier la structure tertiaire.

Présence de détergents : Exemple SDS

Le sodium-dodecyl-sulfate est un détergent très puissant, très hydrophobe. Il dénature la protéine

qui rompt les liaisons non covalentes. Un complexe SDS - protéine dénaturée se forme et comporte une charge négative et seul le poids moléculaire apparait déterminant. MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

II-2. L'électrophorèse en conditions dénaturantes : SDS-PAGE L'Ġlectrophorğse SDS-PAGE (électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium) est une technique consistant à faire migrer des protéines dans un gel, sous l'influence d'un champ électrique, permettant ainsi leur séparation.

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Afin de conforter l'effet rĠǀersible du SDS , du mercapto-éthanol est ajouté pour rompre les

ponts disulfures. MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

II-2. L'électrophorèse en conditions dénaturantes : SDS-PAGE Le gel contient des mailles et peut donc jouer ainsi un rôle de tamis : le gel freine les protéines proportionnellement à leur taille (PM). Les protéines les plus grosses restent proches de leur point de dépôt alors que les petites protéines migrent très loin. II-2. L'électrophorèse en conditions dénaturantes : SDS PAGE MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

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Remarque :

À forte concentration, l'urée peut constituer lui aussi un agent hydrogène (principales liaisons de faibles énergies responsables du maintien des structures secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines). MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

MĠthodes d'analyse et sĠparation des protĠines ͗

II-L'Ġlectrophorğse

II-3- Révélation des protéines après séparation électrophorètique

Lorsque les protéines ont été séparées, leur visualisation peut être effectuée en les

colorant directement (Bleu de Coomassie ou nitrate d'argent). Cette coloration permet de visualiser toutes les protéines. Révélation électrophorèse au bleu de Coomassie RĠǀĠlation Ġlectrophorğse au nitrate d'argentquotesdbs_dbs29.pdfusesText_35

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