TECHNIQUES: Principes de la chromatographie
La chromatographie d'adsorption est basée sur le partage des solutés Papier cellulose
TP 6: CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE. Extraire et identifier
III) Chromatographie du sirop de menthe. - Lorsque le niveau d'eau arrive à la limite supérieure de la silice déposer à l'aide d'une pipette pasteur
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE - Académie des Sciences et Lettres
Comparaison des chromatogrammes de 3 phénothiazines (k'1 = 3 ; k'2 = 65 ; k'3 = 15) en fonction du diamètre des particules d'un gel de silice. Colonne de 25 cm
Chromatographie sur colonne.pdf
Chromatographie éclair (“flash”): elle utilise des particules de silice de 35 à 70 ?m et le solvant s'écoule sous pression d'air comprimé. Première référence à
(Deuxième partie )Techniques Chromatographiques Généralités
Soit à l'intérieur d'une colonne ? chromatographie sur colonne. ? La phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon) maintenue dans une colonne.
4. CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
chromatographie d'adsorption peuvent être utilisées comme support sous forme colonne. En d'autres termes le solvant et la phase stationnaire doivent ...
ANALYSE DES ACIDES NUCLEIQUES
La chromatographie d'adsorption sur colonne de silice. 1.6.2. La chromatographie sur colonne d'échange d'anions. 1.6.3. Purification des ARN messagers
Chromatographie
d'un film (épaisseur 005 à 5 ?m) : WCOT (Wall Coated Open Tubular). 1ères colonnes en acier
Quest quun colorant alimentaire ?
La chromatographie d'adsorption permet de séparer des petites molécules la phase fixe est un solide remplissant une colonne ici la silice. La silice est.
APPLICATION DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE LIQUIDE À
silice entièrement poreux de faible granulométrie permet de préparer des La Chromatographie en phase liquide sur colonne est l'une des plus anciennes.
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La chromatographie d'adsorption est basée sur le partage des solutés entre l'adsorbant solide fixe et la phase mobile Chacun des solutés est soumis à une force
[PDF] LES CHROMATOGRAPHIES
la chromatographie d'affinité? : (on capte l'antigène retenu par les anticorps fixés sur la colonne) qui correspond à un cas où les propriétés d'adsorption
[PDF] 4 CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
Ainsi jusqu'à ces années 1958-1960 la chromatographie en phase liquide sur colonne (CL) bien qu'étant la plus ancienne des méthodes chromatographiques
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C'est une technique basée sur des phénomènes d'adsorption La phase solide le plus souvent l'alumine ou la silice remplit une colonne de longueur et de
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À partir de 1903 Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes On spécula donc l'étymologie du mot chromatographie à partir du
Fiche sur la technique de la chromatographie sur colonne
25 nov 2002 · La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de de sable en tête de colonne au dessus de la surface de silice
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dans la colonne contrairement aux solutés apolaires qui sortent en premier ? Le mécanisme d'action du gel de silice repose sur l'adsorption
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2) de son garnissage : Plus les particules de silice seront fines et plus la colonne sera efficace 3) du débit de l'éluant : Il existe un débit optimal d'
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d'un film (épaisseur 005 à 5 ?m) : WCOT (Wall Coated Open Tubular) 1ères colonnes en acier puis en silice fondue (très pure) (FSOT : Fused Silica Open
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Comparaison des chromatogrammes de 3 phénothiazines (k'1 = 3 ; k'2 = 65 ; k'3 = 15) en fonction du diamètre des particules d'un gel de silice Colonne de 25 cm
Quel est le principe de la chromatographie d'adsorption ?
La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la phase stationnaire.25 nov. 2002Comment fonctionne une séparation par colonne de silice ?
La séparation des composés est provoquée par l'écoulement continu d'un éluant passant dans la colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible pression. Les composés sont entraînés par l'éluant à des vitesses différentes en fonction de leurs affinités avec la silice et avec l'éluant.Quelle Le principe de fonctionnement de la chromatographie en colonne ?
La chromatographie sur colonne est une technique de séparation des constituants d'un mélange. Cette méthode repose sur la différence d'affinité existant entre ces constituants, un éluant (phase mobile) qui les entraîne, et la phase fixe (solide absorbant).- Chromatographie sur colonne est une méthode de purification polyvalent utilisée pour séparer les composés présents dans une solution. Un mélange de solution est porté par un solvant à travers une colonne contenant un adsorbant solide, appelé la phase stationnaire.
TECHNIQUES:
Principes de la
chromatographie 2Définition
La chromatographie est une méthode physique de séparationbasée sur les différentes affinités d'un ou plusieurs composés à l'égard de deux phases (stationnaire et mobile). L'échantillon est entraîné par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a tendance à retenir plus ou moins les composés de l'échantillon à l'aide de différentes interactions. L'échantillon est adsorbé puis désorbé sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins solubledans la phase mobile. 2 3Types de chromatographies
Type Critère de séparation
Adsorption Polarité
Partage Solubilité
Exclusion Taille des molécules
Échangeuse d'ions Charge ionique
Affinité Structure des protéines
Il est rare de pouvoir associer une méthode chromatographique à un seul phénomène. 4Types de chromatographies
Chromatographie
échangeuse d'ions
Chromatographie
d'exclusion 3 5Chromatographies d'adsorption
Phase mobile Nom
GazChromatographie en phase
vapeur (CPV) ou en phase gazeuse (GC)Liquide
Chromatographie couche mince
(CCMou TLC) ou éclairLiquide
Chromatographie liquide à haute
performance (CLHP ou HPLC) 6Utilité de la chromatographie
Selon la quantité de produit appliqué en chromatographie, on s'en sert pour: •Analyser< 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV •Séparer ou purifierles produits d'une réaction par chromatographie éclair ou HPLC (50 mg à 15 g) •Doserdes produits. L'analyse quantitative se fait avec un étalon interne ou après préparation d'une courbe de calibration. 4 7Chromatographie d'adsorption: principe
La chromatographie d'adsorption est basée sur le partage des solutés entre l'adsorbant solide fixeet la phase mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une force d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation. Les séparation sont basées sur le principe de polarité, c'est-à-dire l'existence de dipôles dans une structure moléculaire. Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire): Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine, charbon activé. 8Adsorbants
Les adsorbants sont sous forme de granules
calibrés. La séparation est meilleure, mais plus lente si les grains sont fins.Plus un adsorbant est actif, plus il retient
fortement les composés polaires. La séparation se fait par ordre croissant de leurs forces d'interaction avec les composés polaires. 5 9Polarité des groupements
fonctionnels neutresLe gel de silice est polaire, il
a par conséquence une plus grande affinité pour les composés polaires:Un composé peu polaire
est peu adsorbé.Un composé polaire est
très adsorbé. R-H R-X R-NO 2RORROR
O RR O RH O RNR 2 O ROH O R-NH 2R-OH Ar-OH
Polarité croissante
Les molécules chargées ne migreront habituellement pas sur gel de silice, elles sont trop polaires. 10Phase mobile
Une phase mobile liquide est appelée éluant.C'est elle qui fait migrer les composés, son
choix est donc important. Il faut que le soluté soit solubledans l'éluant.Il est possible de faire des mélanges de
solvants pour changer sa polarité.Polarité croissante
Hexanes
CCl 4Benzène, Toluène
Et 2 O CH 2 Cl 2 AcOEtMeOH, EtOH
AcOH 6 11 Deux facteurs interviennent lors de l'interaction entre l'éluantet le soluté (mélange de composés à séparer): •la solubilité: on doit être en mesure de dissoudre le soluté dans l'éluant pour que la migration se fasse. •la polaritéde l'éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre. Moins un composé est polaire, moins il s'accroche à l'adsorbant, plus il migre avec l'éluant.Choix d'un éluant peu polaire Plus un composé est polaire, plus il s'accroche à l'adsorbant, moins il migre avec l'éluant. Choix d'un éluant polaireChoix de l'éluant
12Chromatographie sur couche mince
L'adsorbant (silice, 250 m d'épaisseur) est fixé sur une plaque (Al, verre) commercialement disponible. Le produit/mélange de produits est déposé sur la plaque à l'aide d'un capillaire. Les produits sont révélés après élution. 7 13Préparation d'un capillaire
Au laboratoire, les capillaires sont préparés au départ de pipettes Pasteur: • Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme d'une torche au propane en tournant le tube jusqu'à ce qu'il soit mou. • Retirer de la flamme et étirer la pipette. • Laisser refroidir et couper la partie fine du milieu. 14Utilité des CCM
1.CCM analytiques(250 m, 2.5 x 7.5 cm)
• Vérifier la pureté d'un produit, quelques microgrammes suffisent • Suivre l'avancement d'une réaction • Vérifier l'efficacité d'une extraction liquide-liquide • Déterminer l'éluant pour la chromatographie éclair sur gel de silice2. CCM préparatives(1000
m, 20 x 20 cm) • Purification de petites quantités de produit (jusqu'à ~100 mg sur une plaque de 20 x 20 cm). La bande qui contient le produit purifié est grattée, puis la silice est extraite avec un solvant. 8 15Préparation de la CCM
ABC1. On trace un trait à ~1 cm du bord inférieur de la plaque.
On marque les futur dépôts, espacés d'environ 0.5 cm.On identifie chaque produit qu'on fera éluer.
2. Le produit/mélange doit toujoursêtre dilué dans
un solvant (Et 2 O, CH 2 Cl 2 , AcOEt...) assez volatil. Dans un vial, déposer 1 goutte ou 2-3 cristaux de produit + ~0.5 mL solvant. 16Élution de la CCM
3. On utilise un capillaire pour déposer le produit sur la
plaque puis on laisse évaporer le solvant. On peut spotter2-3 fois si l'échantillon est très dilué.
4. Élution: préparer une cuve d'élutionavec
•Bécher de 250 mL avec un papier absorbant à l'intérieur •Verre de montre Y verser 10 mL d'éluant (ex. 8 mL Hex + 2 mL AcOEt) Placer la CCM dans la cuve en veillant à ce que la ligne soit au-dessus du liquide. Faire éluer jusqu'à ~5 mm du bord et tracer un trait pour marquer le front de solvant. 9 17Révélation de la CCM
•À l'oeil nu: si le produit est coloré •À la lampe UV: les molécules qui absorbent les UV à 254 nm seront visibles (noyaux aromatiques par exemple). •Avec un révélateur chimique:l'iode est le premier révélateur à tester, car il est non destructif. Il permet de révéler des doubles liaisons et les halogénures. L'iode est évaporé à chaud ou dans la hotte.De nombreux autres existent: KMnO
4 , acide phosphomolybdique, vanilline, ninhydrine...UV KMnO
4 18Mesure du R
fProduit moins polaire, moins accroché
Produit plus polaire, plus accroché
1et 0 entrevaleur solvantdefront du Hauteur migration deHauteur Rf
Le R f (rapport frontal ou rétention frontale) est caractéristique d'un produit dans un éluant donné et pour une phase stationnaire donnée. Ll 1 l 2 10 19Influence de l'éluant
Lorsque la polarité du solvant augmente, le R
f augmente. Le R f augmente, puis diminue. Pour faire une séparation de deux produits par chromatographie, on cherche un éluant qui donne le plus grand R f possible, avec un R f pour le produit le moins polaire autour de 0,3.Polarité de l'éluant
100% Hexane 95% Hexane5% AcOEt90%Hexane10% AcOEt80%Hexane20% AcOEt70% Hexane30% AcOEt
20CCM bidirectionnelles
C'est une expérience qui permet de prouver si un produit décompose sur la silice, ou si un "spot" de la CCM contient en fait deux produits.Si élué dans un autre solvant
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