[PDF] GENIE GENETIQUE Etapes de clonage et construction

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1

IGNEMENT SUPERIEUR

UNIVERSITE DE LA MANOUBA

INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET (ISBST)

SUPPORT DE COURS de

GENIE GENETIQUE

LF3

ECUE Génie Génétique

Elaboré par :

Dr. KHOUAJA Fattouma

Année Universitaire 2019/2020

2

Code UE

ECUE n° 2 Génie Génétique

Code ECUE

Chapitre 2. Les Outils du génie génétique

1. Les enzymes

1.1. Enzymes de restriction

1.2. Ligases

1.3. Polymérases

1.4. Autres enzymes

2. Les vecteurs de clonages

2.1. Plasmides

2.2. Phages

2.3. Cosmides

2.4. BAC

2.5. YAC

2.6. Autres vecteurs (vecteurs viraux eucaryotes...)

3. Les cellules hôtes

3.1. Bactéries

3.2. Levures

3.3. Cellules animales et végétales

Chapitre 3. Les Méthodes de clonage

1. Vecteurs de clonage

3. Importance des marqueurs de sélection

4. Etapes de clonage et construction des Banques géomplémentaires

5. Sélection et criblage moléculaire

4.1. Méthodes de sélection de clones recombinants

4.2. Techniques de criblage des clones par hybridation avec une sonde

oligonucléotidique marquée 5. Le

5.1. Méthode chimique de Maxam et Gilbert

5.2. Méthode enzymatique de Sanger

6. La PCR, RT-PCR, PCR-RFLP et leurs applications

1. Synthèse de substances utiles

2. Diagnostic des maladies héréditaires

4. Transgénèse : Animaux transgéniques et knock-out (intérêts et objectifs, les constructions, la

méthodologie)

5. Thérapie génique : Intérêts et objectifs, Les constructions, La méthodologie

3 Planche 1 : carte de restriction du plasmide pBR322

Planche 2 : carte de restriction du plasmide

pUC18/19 (MCS : multiple cloning sites = région à sites multiples de clonage) Planche 3 : carte de restriction du plasmide pBluescript II SK 4

Dans le site multiple de clonage (MCS) on a placé de part et d'autre du site de clonage BamHI, des

promoteurs phagiques afin de pouvoir transcrire et traduire un gène de l'ADN étranger, qu'il soit

inséré dans un sens ou l'autre. Un cosmide ayant une taille de 4 à 6 kbp en moyenne et devant attendre

de 38 à 54 kbp pour son assemblage automatique a donc une capacité de l'ordre de 45 kbp.

Après assemblage in vitro, les cosmides sont capables de se fixer sur la paroi de la cellule hôte et d'injecter

leur ADN. Celui-ci grâce aux extrémités cos se circularise et se réplique comme un plasmide mais aucune

des fonctions phagiques ne peut être exprimée. De ce fait, les cellules survivent et forment des clones.

Planche 4 : C constitution d'une banque

5 ((221155 KKbb))

Planche 5 Agrobacterium tumefaciens

" Left border » et " right border » : Bordures gauche et droite de la région T du pTi Ce sont des vecteurs permettant de cloner de grands fragments d'ADN (100 à 300 kb) dans les cellules d'E. coli. Ce sont des ADN circulaires, dont l'origine de réplication (OriS) est issue de l'épisome sexuel F de E. coli. Les gènes " parB » et " parA » de l'épisome servent à la répartition correcte du plasmide dans les cellules filles. Le gène " repE » code pour l'enzyme de réplication spécifique de l'épisome. Le gène " CosN » vient du bactériophage . Ce site est reconnu et ouvert par la terminase in vitro. Le gène " CmR » d'origine plasmidique code pour la résistance au chloramphénicol. Ce plasmide est à faible nombre de copies (comme le facteur sexuel F). Il pénètre dans les cellules hôtes par transformation en présence de chlorure de calcium ou par électroporation. Les vecteurs recombinants sont ensuite sélectionnés sur des clones bactériens. Planche 6 : Les BAC (Chromosome Artificiel de Bactérie) 6

Planche 7 : carte fonctionnelle du pYAC

Les YAC sont des vecteurs des cellules

eucaryotes. Ils permettent de cloner de très grands fragments d'ADN (100 à 2000 kb) dans les cellules de la levure

Saccharomyces cerevisiae. La pénétration

dans les cellules hôtes se fait soit par transformation en présence d'ions de calcium ou de PEG (polyéthylène glycol) soit par électroporation. 7

Planche 8 : 2

Ligation

Incubation en présence de ligase

Produits de ligation

Plasmides intacts

Qui se sont recircularisés sans

Plasmides recombinants

Transformation bactérienne par le produit de ligation C'est-à-dire introduction du plasmide vecteur dans la bactérie hôte

Obtention de 3 populations de bactéries

pBR322

Bactéries non transformées :

AmpS TetS

Bactéries transformées (AmpR Tet?) par :

- un plasmide intact non recombinant : AmpR TetR - un plasmide recombinant : AmpR TetS Le gène de résistance à la Tet est inactivé suite à

Sélection par étalement des bactéries sur un milieu de culture + Amp AE seules les bactéries transformées vont se développer sur ce 1er

milieu (AmpR Tet?). Ensuite, les colonies apparues sur ce milieu seront repiquées sur un milieu contenant Amp + Tet AE seules

les bactéries transformées par un plasmide non recombinant vont se développer sur ce 2ème milieu (AmpR TetR). les colonies

qui ont poussé sur le 1er et non sur le 2ème sont celles transformées par un plasmide recombinant ((AmpR TetS)

AmpR TetR

AmpR TetS

Boite de pétri

AmpR Tet ?

M. + Amp

M. + Amp + Tet

Repiquage

Digestion BamH1

Vecteur linéarisé

Digestion BamH1 qui donne des

TetR BamHI

AmpR Pst1

8

Planche 9 :

ADN radiomarquée

c Réplique de la banque : repiquage des clones qui constituent la banque sur plusieurs boites de pétri

T empreinte de chaque boite sur

une membrane (ou filtre) de nitrocellulose ou nylon pour fixer quelques bactéries de chaque clone

Empreinte

Filtre

Boite de

pétri e traitement du filtre par la soude (NaOH) : lyse des bactéries, fixation de dénaturation

ADN sb

Filtre

f hybridation moléculaire

ADN / sonde

Solution

contenant les 8 séquences radiomarquées

Filtre

g élimination de tous les hybridés par plusieurs lavages

U révélation de la

radioactivité par autoradiographie

Film révélé au RX

i retour à la boite initiale : le clone recherché est repéré la tache radioactive plasmidique recombinant, couper partie du gène par PCR ou par séquençage

Le clone bactérien

transformé par un vecteur recombinant ayant inséré le gène recherché 9

Planche 10 : Technique de coupure - réparation

10

Planche 11 : Technique du random-priming

11 12 13 -Dénaturation -95°C pour séparer les 2 brins

-Hybridation de chaque brin avec une amorce spécifique (50 à 60°C qui dépend du % en GC).

-dénaturation Tm

pour un oligonucléotide < 30 nt. La Tm est estimée en utilisant la relation suivante : Tm = 2 (A

+ T) + 4 (G + C) Les 2 oligonucléotides font ~ 15-25nt et doivent avoir des Ta voisines. -Extension ou élongation 14

Principe de

Cette technique peut être réalisée sur des produits PCR amplifiés par des enzymes de restriction.

PCR ou digestion par

des enzymes de restriction 15

Analyse du polymorphisme par RFLP

ouple enzyme/sonde pour détecter une mutation qui supprime ou crée un site de restriction

Les étapes de la technique RFLP

c T à des sites de restriction (ou PCR dans le cas e

séparer les fragments de restriction. La révélation au BET ne permet pas de distinguer individuellement

les fragments car ils sont trop nombreux (traînée de coloration le long de la piste de migration =

smeer), en plus il est impossible de repérer les fragments homologues. Pour cela, il est nécessaire

f Transfert selon Southern g Hybridation moléculaire par des sondes ADN marquées (radioactives ou fluorescentes)

U Révélation par Autoradiographie.

16 (a) (b (c 3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétisé qui est complémentaire et

Sens de migration

Sens de migration

3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétisé

Haut poids

moléculaire faible poids moléculaire

Amorce ADN simple brin

synthétisé Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP (suite page suivante) 17 (d) (e) (suite): Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP. (a) Cette technique consiste à la synthèse in vitro

amorce marquée et une ADN polymérase) de nucléotides de synthèse modifiés et analogues structuraux de

nucléotides: les didésoxyribonucléosides triphosphates (ddNTPs) dépourvus du groupement OH

hosphate suivant. Une fois de leur incorporation AE (b)Etapes du séquençage selon Sanger

Quatre réactions sont pré

ddCTP, ddGTP), ainsi que les 4 dNTPs normaux. Un ddNTP sera incorporé au hasard à des sites distincts

(c)

Les fragments tronqués sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (pouvant séparer

(marquage radioactif de la sonde par fluorescence).

résultats obtenus dans les 4 tubes (les plus petits fragments migrent toujours le plus vite). La lecture de

AE AE AE (d) fluorochromes différents

Actuellement, le séquençage est devenu automatisé : " séquençage automatique » qui présente le même

séquençage les plus récentes marquent les 4 types de ddNTP par des fluorochromes de couleur différentes

spécifiques pour chaque type de nucléotide (ddTTP-ROX (rouge), ddATP-JOE (vert), ddGTP-TAMRA (noir) et ddCTP-5-FAM (bleu)) : gel de séquence et les données de séquence sont enregistré grâce à un rayon

laser qui capte la fluorescence émise par chacun des 4 fluorochromes au cours de la migration des

fragme enregistrée et interprétée dans la banque de données de Les réactions peuvent ainsi se dérouler dans le même tube (e) : Electrophérogramme de séquençage

Les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu'à

1000 pb pour les appareils les plus performants

18

Animaux transgéniques et knock-out

Figure 1 . Le génotype commande le phénotype Figure 2 . La technique du Knock Out consiste en le remplacement des deux copies d'un gène, dans le génome de l'organisme, par un autre allèle (le plus souvent, inactif)

Figure 3 . Il est nécessaire de disposer du gène à invalider et des séquences le bordant dans le

génome avant de pouvoir procéder à son invalidation 19

La technique d'invalidation d'un

gène se base sur la recombinaison homologue : On peut ainsi remplacer le gène complet, présent dans le génome de l'organisme, par une version suffisamment incomplète du gène pour qu'il ne s'exprime pas, ou par un autre gène (ce qui permet de suivre l'expression du gène invalidé). Figure 4 . Un exemple de méthode pour invalider un gène : le remplacer par un autre gène, par exemple un gène "rapporteur" tel que le gène lac Z (qui code pour la ß-galactosidase) La description suivante est faite chez la souris. Elle est valable pour tout organisme Mammifère. Figure 5 . Un exemple de vecteur de recombinaison homologue : plasmide bactérien portant le

gène lac Z (qui remplace le gène invalidé), avec en amont et en aval des séquences qui entourent

le gène à invalider dans le génome de l'organisme 20

Figure 6 . Réalisation de cellules ES modifiées. A. Un vecteur a été réalisé : plasmide portant le

gène lac Z (dans notre exemple), entouré des cellules bordant le gène A dans le génome. Ce

vecteur est introduit dans des cellules ES (transfection). B. Dans quelques cellules ES, un

évènement de recombinaison homologue a lieu : grâce à une reconnaissance des séquences

communes entre le vecteur et le génome de la cellule, une copie du gène A est remplacée par la

construction portée par le vecteur (ici, le gène lac Z). C. La majorité des cellules ES n'ont en fait

pas réalisé cette recombinaison homologue. Les quelques cellules ES qui l'ont réalisée sont

sélectionée, multipliées, et vont permettre la suite du protocole. Figure 7 . L'injection de cellules ES recombinées dans de très jeunes embryons de souris (ces

cellules s'intègrent à l'embryon) permet l'obtention d'individus mosaïques, dérivant pour partie

de cellules non modifiées, et pour partie de cellules recombinées 21

Figure 8 . Le croisement d'une souris mosaïque (dont les cellules sexuelles dérivent des cellules

ES recombinées) avec une souris sauvage ne possédant pas cette mutation permet d'obtenir, pour

50% de la descendance, des souris hétérozygotes pour cette mutation.

Figure 9 . Le croisement des hétérozygotes obtenus précédemment entre eux permet l'obtention

(dans la proportion de 1/4 de la descendance) d'individus homozygotes : ce sont les individus "KO", chez qui le gène a été invalidé 22

Figure 10 . L'invalidation d'un gène est le remplacement de ce gène, dans le génome de

l'organisme, par une version modifiée, inactive de ce gène. Dans cet exemple, le gène A est

remplacé par un autre gène, lac Z. Ce remplacement est permis par la présence de séquences

identiques entre la construction et le génome de l'organisme, au niveau desquelles peut se

réaliser une recombinaison homologue

Figure 11 . Bilan : différents résultats sont obtenus, grâce à la recombinaison homologue, en

fonction de la construction réalisée au départ : Knock Out (invalidation du gène), Knock In

(remplacement par un autre gène), ou mutagenèse dirigée (remplacement par un allèle muté).

23
23
Fig 1 : Essais cliniques approuvés de thérapie génique dans le monde Fig 2 : Essais cliniques de thérapie génique Méthodologie de la TG moyennant des vecteurs viraux : Une méthode en 4 étapes :

Etape c

Grâce aux connaissances relatives au génome humain, on parvient facilement et rapidement à isoler un gène et à le cloner (PCR) cellule-cible Le vecteur généralement utilisé est un virus : adénovirus et rétrovirus. Thérapie génique Intérêt, objectifs, constructions et méthodologie 24
24

Pour produire ces vecteurs viraux, Ces ¢

expriment, normalement, les protéines virales formant la capside de façon stable. En thérapeutique conduit à la formation de particules virales complètes contenant vecteur. Étape e : Administration du vecteur (3 protocoles ),

De nombreux essais cliniques de thérapie génique ont utilisé une stratégie de protocole dite ex

vivo, c'est-à-dire

de transfert du gène thérapeutique en dehors de l'organisme. Les cellules sont ensuite

réinjectées au patient. Cela permet aux chercheurs dans certains cas d'évaluer l'ampleur de la

modification génétique tant au niveau du pourcentage de cellules modifiées génétiquement qu'au

niveau de l'expression des protéines thérapeutiques, ou de présélectionner des populations

cellulaires particulières (ex.: les cellules souches sanguines). Néanmoins, certaines stratégies,

notamment celles visant à éliminer des tumeurs, ou celles visant à modifier génétiquement des

cellules qu'on ne peut manipuler hors de l'organisme, utilisent une approche dite in vivo en

injectant directement le vecteur dans le tissu ciblé et en le laissant agir librement. 25
25
la thérapie génique ex vivo :

prélever sur le patient les cellules cibles, les modifier génétiquement avec le vecteur viral

porteur du gène d'intérêt thérapeutique, puis à les réintroduire chez le patient. Cette

méthode est en particulier utilisée pour les cellules sanguines, faciles à prélever et à

réintroduire. la thérapie génique in situ :quotesdbs_dbs30.pdfusesText_36

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