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2MiB}+ `2b2`+? /Q+mK2Mib- r?2i?2` i?2v `2 Tm#@

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LLh, kyRjSRRkydeX i2H@yRRk9RyN

Université Paris Sud XI Orsay

Ecole doctorale Gènes Génomes Cellules

Thèse de doctorat en Sciences de la Vie

Caractérisation de flores microbiennes

intestinale humaine et fromagère par méthode de métagénomique quantitative

Mathieu Almeida

Présentée et soutenue publiquement le 7 juin 2013

Composition du Jury :

Mr Pierre Capy Président

Mme Claudine Médigue Rapporteur

Mr Mihai Pop Rapporteur

Mr Johan van Hylckama Vlieg Examinateur

Mr Emmanuel Jamet Examinateur

Mr Stanislav Dusko Ehrlich Co-directeur de thèse

Mr Pierre Renault Directeur de thèse

Thèse Mathieu Almeida - 2013

2

Thèse Mathieu Almeida - 2013

3

REMERCIEMENTS

Je voudrais commencer ce manuscrit croisé

chance de côtoyer tous les jours des personnes formidables, je voudrais leur exprimer ma fierté et ma

mon directeur de thèse cela. de pour cela. ne, quelques semaines

Thèse Mathieu Almeida - 2013

4

Je re

les plus ma vie personnelle. Je tiens à les remercier tout particuliè

Finalement, j pour leur amour et leur

Thèse Mathieu Almeida - 2013

5

RÉSUMÉ

La flore microbienne

définie car en 2012, seules ~30% des micro données. correspondan n de la flore intestinale

niveau des flores alimentaires, nos méthodes ont été utilisées pour constituer un catalogue de 134

romagères et caractériser la flore de surface de fromages

Mots clés

Thèse Mathieu Almeida - 2013

6

SUMMARY

The microbial flora is a micro

Keywords

Thèse Mathieu Almeida - 2013

7

LEXIQUE

core: ensemble de cluster: clustering:

contig: chevauchement de plusieurs séquences provenant de séquenceur à ADN créant une séquence

CRISPRmotif de quelques nucléotides de taille (de 24 à 48 nucléotides) localisé dans le génome

draft:fragments génomiques. flore microbienne:ensemble des micro k: mot d métagénomique:

écosystème.

métagénomique quantitative:abondance relative des fragments génomiques provenant de tous les

MGU (MetaGenomic Unit) ou unité métagénomique: MGS (MetaGenomic Species) ou espèces métagénomiques: sein de plusieurs échantillons. contig/scaffold : la plus grande longueur contenant au moins la moitié de la somme cumulé valeur médiane des longueurs, en apportant plus de poids séquence : courte insert déterminé mais de taille connue. scaffold: jointure de deux shotgun sequencing: séquençage global aléatoire d pan

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Table des matières

AVANT PROPOS

INTRODUCTION

I CARACTERISATION DE

I.1 CARACTERISATION PHENO

I.1.1 Le microscope optique et les premières

I.1.2 Le microscope électronique et la découverte des virus. I.2 CARACTERISATION GENOT................................ I.2.3 Les séquenceurs à ADN automatisés et le premier génome bactérien complet. I.2.4 Le déluge de génomes bactériens complets par utilisation des séquenceurs multi

I.3 CARACTERISATION DES F

II CARACTERISATION D

II.1 LA METAGENOMIQUE ET L'ECHANTILLONS METAGEN

II.2 SEQUENÇAGE D'ECHANTILLONS METAGEN

II.2.1 Séquençage

II.3 TRAITEMENTS BIOINFORM'ADN .

II.3.1 Méthodes de caractérisation par alignement des séquences sur référence connue

II.3.2 Méthodes de caractérisation par assemblage des courtes séquences en catalogue de référence

II.3.3 MĠthodes d'assignation des espğces microbiennes par clustering

II.4 AVANTAGES ET LIMITES

METHODES ET RESULTAT

III RECONSTRUCTION D'UN CATALOGUE DE GENES DE LA FLORE INT

III.1 ÉTAT DE L'ART ET PROBLEMATIQUE

III.1.1 La flore intestinale

III.1.2 Les séquenceurs de seconde génération et le catalogue de gène MetaHIT.

III.1.3 NĠcessitĠ de dĠǀelopper une mĠthode de regroupement et d'analyse des dépendances

III.2 ARTICLE: DEPENDENCIES AMONG ME, , .

III.3 DEVELOPPEMENT METHODO

III.3.1 Méthode de regroupement par co

III.3.2 Comparaison des résultats des deux méthodes III.3.4 Présentation des unités et espèces métagenomiques qualité III.3.6 Classification des individus en Enterotype III.4 DISCUSSION SUR LA CLA'UN CATALOGUE METAGENMGU MGS

Thèse Mathieu Almeida - 2013

9

III.4.1 Identification et reconstruction de gĠnomes d'espğces connues et inconnues directement ă partir

III.4.2 Découverte de nouvelles branches phylogénétiques et de génomes atypiques.

III.4.3 La liste d

III.4.4 Les MGS facilitent l'Ġtude d'association entre l'obĠsitĠ, l'inflammation intestinale et la composition

au cours du temps chez 49 individus obèses français

IV CONSTRUCTION D'UN CATALOGUE GENOMIQUE AL

IV LES PRODUITS LAITIERS:

IV.2 BESOIN D'ETABLIR UNE BASE DE

IV.3 ARTICLE: CONSTRUCTION OF A FOO, .

IV.4 DEVELOPPEMENT METHODO

IV.4.2 Réassemblage optimisé des clusters de fragment en ass

IV.4.3 Qualité des assemblages génomiques

IV.4.4 Assignation phylogénétique des génomes

IV.5 DISCUSSION SUR LA CRE'UN CATALOGUE DE GENO

IV.5.1 Une nouvelle méthode de clustering

IV.5.2 CrĠation d'un catalogue alimentaire reprĠsentatif de la diǀersitĠ bactĠrienne des milieux alimentaires IV.5.5 Premiğre caractĠrisation fonctionnelle de l'Ġcosystğme fromager.

CONCLUSIONS ET PERSP

V CONCLUSIONS ET PER

V.1 APPORT DU TRAVAIL AU

V.1.1 Une méthode de regroupement adaptée aux données métagénomiques complexes et simples

V.1.2 Un élargissement des bases de données génomique de références V.2 AIDER A LA CARACTERIS'ISOLEMENT DE NOUVEAU'INTERET V.3 APPLIQUER LA METHODE 'AUTRES ECO'AUTRES TYPES DE V.4

V.5 DEFINIR DE NOUVEAUX M

PUBLICATIONS

REFERENCES

ANNEXE

ANNEXE 1 DONNEES SUPPLEMENTAIR

ANNEXE 2 DONNEES SUPPLEMENTAIR

ANNEXE 3 WORDLE GRAPHIQUE DES

Thèse Mathieu Almeida - 2013

10

TABLE DES FIGURES

FIGURE 1: CARACTERISATION GRAM ET MICROSCOPIE O.

FIGURE 2: OBSERVATION D'UN VIRUS PAR MICROSC.

FIGURE 3: CARACTERISATION DE LA'ADN X.

FIGURE 4: LECTURE DE LA SEQUENC'UN FRAGMENT D'ADN SANGER.

FIGURE 5: GRAPHIQUE DE L'EVOLUTION DU NOMBRE

GENBANK AU COURS DU T.

FIGURE6: CARACTERISATION PHYLO'UN ARBRE PHYLOGENETI31

FIGURE 7: SCHEMA REPRESENTANT L.

FIGURE 8: SCHEMA PRESENTANT LA 'ADNR 16S.

FIGURE 9: SCHEMA DES ETAPES D'UN SEQUENÇAGE 454 FLX TITANIUM PAR AMPLIFIC. FIGURE 10: ETAPES DE SEQUENÇAGE SOLID 5500 (EN HAUT) ILLUMINA HISEQ 2000 (EN BAS).

FIGURE 11 EXEMPLE DE VISUALISAT'OUTIL TABLET.

FIGURE 12: LES DIFFERENTES ETAPEMETAHIT.

FIGURE 13: METHODE D'ASSIGNATION TAXONOMI'ANCETRE COMMUN MINIMMEGAN. FIGURE 14: ILLUSTRATION DE LA VI'UNE SEQUENCE D'ADN ......

FIGURE 15: CHAINE DE TRAITEMENT ABUNDANCEBIN.

FIGURE 16: EXEMPLE DE MATRICE DEMETAHIT.

FIGURE 17: CHAINE DE TRAITEMENT 3,9 METAHIT

FI18: SCHEMA DES ETAPES DE 'OUTIL _METAPROF.

FIGURE 19: HISTOGRAMME DE LA CORPEARSON DES CLUSTERS .

FIGURE 20: DISTRIBUTION DU NOMBR.

FIGURE 21: ETAPES DE REASSEMBLAG.

FIGURE22: DOTPLOT DE L'ALIGNEMENT ENTRE LE BIFIDOBACTERIUM ANIMACNCM I

MGS BIFIDOBACTERIUM ANIMAMETAHIT.

FIGURE 23: HISTOGRAMME DU POURCE.

FIGURE 24: GRAPHE DES SCORES AUC 'ETAT D'OBESITE.

FIGURE 25: DISTRIBUTION DU NOMBR123 -OBESE ET 169

FIGURE 26: DISTRIBUTION49 , 0, 6 12.

FIGURE 27: DISTRIBUTION DES VALEAUC 'ETAT DE FAIBLE DIVER

FIGURE 28: PRESENTATION DE LA MECANOPY.

FIGURE 29: DOTPLOT D'ALIGNEMENT NUCLEOTIDIQUE ARTHROBACTER ARILAITERE117

NCBI 'ASSEMBLAGE ARTHROBACTER ARILAITERE117 'UN30

FIGURE 30: ARBRE PHYLOGENIQUE CEAEROCOCCUS VIRIDANS TL327A. FIGURE 31: HEATMAP DE LA COMPOSI562 2KB DU CLUSTER AEROCOCCUS. FIGURE 32 PRESENTATION DE L'INTERFACE DE REGROUP'OUTIL METEOR.

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11

TABLE DES TABLES

TABLEAU 1 FREQUENCE DE QUELQUES5 METAHIT.

TABLEAU 2 PRESENTATION DES 31 MGS 90% .

TABLEAU 3 TAXONOMIE DES CLUSTER(TEST WILCOXON,

<0,05). TABLEAU 4 PRESENTATION DES 26 'ABONDANCE EST SIGNIF. TABLEAU 5: DETAIL DU NOMBRE DE C5 'ASSEMBLAGE DE LA FLO.

TABLEAU 6 MATRICE DE SIGNATURE , 6 SOLID.

TABLEAU 7 COUVERTURE DE QUELQUE'ADN ILLUMINA 1.

TABLEAU 8: STATISTIQUES DES TAIL

, 2. TABLEAU 9 EVALUATION DES CRITER'AEROCOCCUS VIRIDANS TL327A.................................

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12

AVANT PROPOS

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13 Les microscope, jusq

génétique contenue au sein de leur cellule. Cette caractérisation est nécessaire pour comprendre le rôle

, la majorité des isolem génique méthodes métagénomique, lèvement métagénomique sont métagénomique quantitative. non structurées en espèce précisément le nombre abondance relative les assemblages) une

ADN global . Ce

associations entre le humaines (peau, bouche, vagin, etc)

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14 poursimplifier son utilisation dans des analyses cliniques aient déjà en , en présentant leurs limites sur des échantillons peu

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15 INTRO

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16 I CARACTÉRISATION DES M-ORGANISMES PAR MÉTHO

I.1 CARACTÉRISATION

caractérisationsième utilisation i Kingdom, Embranchement ou Phylum, Classe ou Class, Order, FamilleFamily, GenreGenus, EspèceSpecies, ici du plus large au plus isolement vers la fin du 19ième bactérie simple paroi enrichie en peptidoglycane dites Gram positives, Figure 1: Caractérisation bactérienne par coloration de Gram et microscopie optique. droite : microscope optique modèle Zeiss, 1874. phénotypiques. I. ième ,2000

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17 .entités virus.

Figure 2

A gauche : virus de la mosaïque du tabac vue par microscopie électronique (échelle en bas à droite :

0,2 µm). A droite : microscope électronique modèle Ernst Ruska, 1933, premier modèle avec une

précision supérieure au microscope optique. virus bactériophage phage, 1931
concentrés par affichentde moins de 0,01 µm.

1935, et les termes

I.

Entre 1869 et 1889, une nouvelle substance

ique ADN. de nucléotides e bonne qualitéi par microscopie électronique

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18 microscop Figure 3 : Caractérisation de la structure en double hélice de rayon X.

A gauche : schéma du microscope électronique à rayon X modèle KB, 1948. A droite, image en

photo 51 » de

Rosalind Franklin et Raymond Gosling, 1952).

la caractérisation de la structure génomique des organismes, classification phylogénétique.

I.2 CARA

et la ) fut er. e 16S ou , montrant que - archéobactéries,comme les plus eucaryotes[ superkingdom) : les bacteries (ou eubacterie), les a

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19 virusou de l, ou la forme de la capside. I.

établi

gène [Jou et al codons autoradiographie différentes selon le cadre de lecture dideoxy me fragments assemblage

Figure 4

après séquençage par la méthode Sanger. produits de séquençage par électrophorèse et leur révélation par autoradiographie, après 2,5 heures de migration (à gauche) et 5 heures de de faire migrer les fragments selon leur taille, les plus petits en bas de la figure, les plus grands en haut. Plus le temps de migration est long, plus les fragments migrent, permettant la lecture des grands fragments par autoradiographie. Dans cet exemple, il faut lire la séquence de bas en haut, ce qui donne sur la figure de gauche :

A, puis C, G, T, G, G...

La lecture reste difficile car les bandes peuvent être difficilement distinguables, et plusieurs itérations sont nécessaires pour réassembler la séquence entière (Figure extraite de la lecture de Frederick Sanger lors de la remise de son second Nobel de chimie en 1980).

Thèse Mathieu Almeida - 2013

20 I. La première génération de séquenceur à ADN ABI Prism 370A)

radioactifs instables par des sondes de 4 couleurs différentes (pour les 4 différentes bases), qui sont

également au cours des années 1980 que les ordinateurs se généralisent au sein des laboratoires de

Pour centraliser les informations de séquençage génique généré par les premiers séquençages,

I nformatique world wide web web) et des navigateurs web

Haemophilus influenzae, composé

toutes les analyseoptimisation de toutes les étapes, du séquençage I.

ABI, permettant de générer en un jour

, ne nécessite

Thèse Mathieu Almeida - 2013

21

Figure 5

de données Genbank au cours du temps.

A gauche : nombre de soumission de génomes procaryotes complets à la Genbank de 1995 à 2009. Le

décrochage observé en 2001 est dû en partie à la sortie du séquenceur multi-capillaires ABI PRISM

3700 en 1999 (à droite), permettant de séquencer ~1000000 nucléotides par jour. [Springer, 2006].

En 2005, le genre Streptococcus

Streptococcus agalactiae

core a environ espèce, aussi appelé pan-

Escherichia coli[

le pande frontière

La notion de core

Bacillus subtilis

marqueur phylogénétique

Thèse Mathieu Almeida - 2013

22
I.2.5

Le séquençage du génome complet eun

D

Escherichia co,

D rpoB, argS leuS, sont les différents de longueur du plus petit marqueur). [arbre phylogénétique

Figure 6 : Caractérisation

phylogénétique du vivant par utilisant 31 protéines marqueurs. après alignement et concaténation de 31 protéines présentes chez 191 espèces, dont des espèces eucaryotes (en rouge), bactériennes (en bleu) et archées (en vert). Les tailles des branches représentent les distances entre les espèces, sauf entre les eucaryotes et les archées, où la taille de la branche a été réduite pour faciliter la lecture de [Ciccarelli et al, 2006]. D equotesdbs_dbs1.pdfusesText_1

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