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UNIVERSITE PARIS SUD

FACULTE DE MEDECINE PARIS SUD

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS SUD

Ecole Doctorale 419 " Signalisations et réseaux intégratifs en Biologie, Bio-SigNE»

Présentée et soutenue publiquement par

Aurore JACQUOT

Le 30 novembre 2012

Co-expression et caractérisation fonctionnelle

d'un transporteur de lipides (" Flippase ») de la levure S. cerevisiae : l'ATPase P4 Drs2p, en complexe avec sa sous-unité associée Cdc50p.

Directeur de thèse: M. Marc le MAIRE

Co-directeur de thèse : M. Guillaume LENOIR

JURY

Mr Oliver NÜSSE (Président du Jury)

Mme Isabelle MUS-VETEAU (Rapporteure)

Mr Patrice CATTY (Rapporteur)

Mme Sophie CRIBIER (Examinatrice)

Mme Karine MONCOQ (Examinatrice)

Mr Marc le MAIRE (Examinateur, directeur de thèse)

Remerciements

Je tiens tout d'abord à remercier Marc le Maire et Guillaume Lenoir d'avoir accepté d'être mes

directeurs de thèse. Je les remercie pour leur accueil, leur patience (en particulier pour Guillaume), leur

disponibilité, leur soutien et pour m'avoir accordé leur confiance.

Je tiens particulièrement à remercier Guillaume pour son encadrement, ses conseils et la patience dont il a

fait preuve afin de me transmettre ses méthodes de travail.

Je remercie également Philippe Champeil pour toutes les discussions passionnantes et enrichissantes que

nous avons eues. Je remercie Philippe et Cédric Montigny pour leur énorme contribution à ce travail et

leur disponibilité. Je remercie Hassina Azouaoui et Raphaëlle Barry avec qui j'ai eu la chance de travailler pour nos

discussions, les manips réalisées ensemble et l'amitié qui a découlé de ces moments passés ensemble.

Je remercie spécialement Christine Jaxel pour son soutien, ses conseils et sa grande disponibilité.

Je remercie Manuel Garrigos, Béatrice de Foresta, Veronica Beswick, Alain Sanson, Pierre

Nédellec, Nadège Jamin, Francis Haraux et Claire Lemaire pour leur conseil et leur disponibilité.

Je remercie aussi les " jeunes » que j'ai rencontrés durant ces trois années : Cindy, Paul, Stéphanie,

Sana, Qian, Margaux, Lila, Gaëlle, Céline, Tiona, Mehdi et. Je les remercie pour leur soutien,

leur bonne humeur et leur disponibilité. J'en profite pour remercier également Pascale, Josiane et tout le

personnel administratif pour leur disponibilité afin de résoudre tous les petits problèmes que j'ai pu rencontrer.

Je tiens aussi à remercier Lisette Cohen, ma tutrice de monitorat, pour ses conseils, sa patience, sa

disponibilité et la confiance qu'elle m'a accordée concernant l'enseignement. J'en profite pour remercier

toute l'équipe pédagogique de l'Université Paris Sud avec qui j'ai eu le plaisir de travailler ainsi que les

préparatrices de TP et Martine Bouillault qui m'ont gentiment intégrée à leur table. Je remercie Pontus Gourdon, Poul Nissen, Frank Fijalkowski, Miriam-Rose Ash et plus

particulièrement, Hanka Hennrich et Joost Holthuis pour leur collaboration au cours de ces trois années.

Je remercie les membres du Jury : Isabelle Mus-Veteau, Patrice Catty, Sophie Cribier, Karine

Moncoq et Oliver Nüsse d'avoir accepté d'évaluer ce travail. Je remercie Thierry Touze d'avoir accepté

d'être mon tuteur de thèse.

Je tiens à remercier spécialement mes parents, ma soeur, mon frère, mes grands-parents (même si

malheureusement tous ne seront pas là pour voir l'aboutissement de toutes ces années d'études), mes oncles,

tantes, cousin(e)s, Jean-Pierre, ma belle-famille ainsi que mes amies Lucie, Mélanie, Paola, Farah, Anaïs et Julie pour leur énorme soutien depuis plusieurs années.

Enfin, je tiens à remercier du plus profond de mon coeur mon ami, Efrahdine, qui me soutient depuis de

nombreuses années et sans qui tout cela n'aurait pas été possible.

Plasmide

Plasmide

Chromosome

-72 -60 -48 -36 -24 -12 0 12

0,1110100

-20 -10 0 10 20

0,11101001000

Acid-stable

32P after treatment,

pmol per 0.1 mg total protein 0123
0 2 4 024

Time, min

0 2 4

Time, min

0 2 4

0 2 40 2 4

Time, min

0 2 4

32P retained on the filter, pmol

024

E ( Y + SR )

on ice, ATP 2 µM

A ( D+ )B ( D+ ) C ( D+ )

D ( D*

+, D560N )F ( Y + SR )(preincubated at pCa 8)(preincubated at pCa 4)24°C, ATP 2 µM on ice, ATP 0.5 µM on ice, ATP 2 µM on ice, ATP 2 µM on ice, ATP 2 µM +VO4 +VO4 +VO4 +VO4 +VO4 +VO4 [KF], M

10-410-3

[VO4], M

10-710-610-510-410-3

32P retained on the filter, pmol

024
0

Incubation period (here, on ice), min

0 5 10 25 50 75

024
0

10-610-5

P retained on the filter, pmol

024

0 [AlCl3] total , M

10-610-510-610-5

32P retained on the filter, pmol

Incubation period (here, on ice), min

0 30 60 90 120 150 180 210

024

3 total

+/- Al. chelatorKF + AlCl3

Al. chelator

꘩tz꠩ ꘩tz꠩

Time, min

0 2 4

32P on the filter, pmol

024

Y aloneY+SR

Time, min

???32P on the filter, pmol/0.1 mg protein?

Time, min

Time, min

Time, min

32P on the filter,

pmol/0.1 mg total protein

Time, min

Time, min

32P on the filter,

pmol/0.1 mg total protein

Time, min

Time, min

0 2 4

Time, min

0 2 4

32P on the filter, pmol

024

Time, min

0 2 4

32P on the filter,

pmol/0.1 mg totam protein 04812
- VO4 + VO4 Elution volume, ml (or time, min)6 7 8 9 10 11 12 OD 280
, mAU 02040
Elution volume, ml (or time, min)6 7 8 9 10 11 12 OD 280
, mAU 04080
Elution volume, ml (or time, min)6 7 8 9 10 11 12 OD 280
, mAU 02040
Drs2p

Cdc50p

Drs2p

32P on the filter, pmol per

0.1 mg of total protein

0123
- VO4 + VO4 + + 1302 1283 1249 1226 195 + 12_0206 Papadopulos A et al. J. Biol. Chem. 2007;282:15559-15568 Drs2p

Atp8a2

Atp8b1

A

0 4 8 12 16

0123

32P on the filter,

pmol/0.1 mg total protein 0123
D+ D*+

Membrane-detergent incubation period, hours

0 4 8 12 16

32P on the filter,

pmol/0.1 mg total protein 0123
none DDM C12E8 TX-100 CHAPS Digit. diC7PC Detergent :

DDMdet./prot. = 10 g/g DDM/prot., g/g :

CB C12E8

TX-100

2 0.5 0 10 det./prot. = 10 g/g, 1 minute incubation

Phosphatidylserine Stimulation of Drs2p?Cdc50p LipidTranslocase Dephosphorylation Is Controlled byPhosphatidylinositol-4-phosphate

Joost Holthuis

F-91405Orsay,France,and

University,3584 CH Utrecht, The Netherlands

Background:Transport of phosphatidylserine (PS) analogs by the Drs2p flippase is regulated by PtdIns(4)P.

Results:PS stimulates dephosphorylation of the Drs2p?Cdc50p complex only in the presence of PtdIns(4)P.

Conclusion:The step at which PtdIns(4)P regulates lipid transport is identified.

Significance:Our coordinated overexpression system provides mechanistic insight into PS transport and will be useful for

further Drs2p characterization and crystallization. Here, Drs2p, a yeast lipid translocase that belongs to the fam- ily of P

4-type ATPases, was overexpressed in the yeastSaccha-

romyces cerevisiaetogether with Cdc50p, its glycosylated part- resulting high yield allowed us, using crude membranes or detergent-solubilized membranes, to measure the formation from [ ?-32P]ATP of a32P-labeled transient phosphoenzyme at the catalytic site of Drs2p. Formation of this phosphoenzyme by orthovanadate and fluoride compounds. In crude membranes, thephosphoenzymeformedatsteadystateat4 °CdisplayedADP- insensitive but temperature-sensitive decay. Solubilizing concen- of phosphatidylinositol-4-phosphate. These results explain why phosphatidylinositol-4-phosphate tightly controls Drs2p-cata- lyzed lipid transport and establish the functional relevance of the

Drs2p?Cdc50pcomplexoverexpressedhere.

A hallmark of eukaryotic cells is the fact that plasma mem- branes as well as membranes of the late secretory pathway, includingthetrans-Golginetwork(TGN),

2displayasymmetriclipid distribution with the aminophospholipids phosphatidyl-serine (PS) and phosphatidylethanolamine essentially confinedinthecytosolicleaflets(1,2).MaintenanceofthisasymmetryiscriticalformanyphysiologicalprocessesasPSexternalizationisassociated, for example, with blood coagulation, macrophage-dependent clearance of apoptotic cells, and virus entry (3-5).The transbilayer distribution of aminophospholipids is largelydeterminedbythepresenceofATP-drivenlipidtranslocasesor"flippases" (6-8), and converging lines of evidence indicatethat members of the P

4subfamily of P-type ATPases (9), here-

afterreferredtoasP

4-ATPases,constitutesuchflippases.There

are five P

4-ATPases in the yeastSaccharomyces cerevisiae

Deletion of Dnf1p and Dnf2p inhibits ATP-dependent NBD- PC, -PS, and -phosphatidylethanolamine transport (12), whereas removal of Drs2p abolishes NBD-PS and -phosphati- dylethanolamine transport (13, 14). The yeast P

4-ATPase

Drs2p, like the mammalian P

4-ATPase ATP8A2, was recently

purified and reconstituted into proteoliposomes, demonstrat- ing that these P

4-ATPases are directly involved in the translo-

cation of PS analogs (15-17).

It is also clear now that the association of P

4-ATPases with

Indeed, Cdc50 proteins have been shown to be required for stabilityandexportofP

4-ATPasesfromtheendoplasmicretic-

*This work was supported by the CNRS and Commissariat à l"Energie Atom- ique, by a fellowship from the "Ministère de l"Enseignement Supérieur et de la Recherche" (to A. J.), and by a grant from the Agence Nationale pour la Recherche (to C. M., C. J., and M. l. M.).

1To whom correspondence should be addressed: iBiTec-S and UMR 8221,

6908-8139; E-mail: guillaume.lenoir@cea.fr.

2The abbreviations used are: TGN,trans-Golgi network; P2- or P4-ATPase,

endoplasmic reticulum Ca

2?-ATPase, isoform 1a; Bad, biotin acceptor

domain; TEV, tobacco etch virus; DDM,n-dodecyl ?-D-maltoside; C12E8, octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether; diC

7PC, 1,2-diheptanoyl-sn-

quotesdbs_dbs27.pdfusesText_33

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