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CHIMIE ANALYTIQUE

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  • Quel est le principe de l HPLC ?

    Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique.20 jan. 2010

  • Comment analyser HPLC ?

    Le résultat observable d'une analyse HPLC se présente sous la forme d'une courbe du signal détecté en fonction du temps : c'est le chromatogramme. Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de caractéristiques différentes : le temps de rétention ou tR, temps du maximum du pic.

  • Pourquoi on utilise HPLC ?

    L'HPLC est l'une des techniques les plus employées dans les laboratoires d'analyses chimiques. Elle permet l'identification, la séparation et le dosage de composés chimiques dans un mélange. Sa grande précision permet la recherche de traces et il est possible de la coupler à un spectromètre de masse.
  • En HPLC, que l'injection soit manuelle ou automatique, l'injection se fait avec une boucle d'injection qui doit être remplie puis sera injectée dans le système. Le volume de la boucle d'injection joue un rôle majeur dans le volume d'échantillon injecté. De manière générale les boucles d'injection vont de 1 à 100 µL.
Chromatographie Liquide de Haute Performance (CLHP-HPLC)

Introduction

X. Bataille - ENCPB - 2008

Principe de la CLHP

Séparation de constituants dans un

mélange complexeMise en solution dans un solvant ou un mélange de solvant (éluant)Analyse qualitativeAnalyse quantitative

X. Bataille - ENCPB - 2008

X. Bataille - ENCPB - 2008Principe

X. Bataille - ENCPB - 2008Schéma

X. Bataille - ENCPB - 2008CLHP

Apparition: années 1950Chromatographie:

séparation et quantificationLiquide: travail en solutionHaute performance:

Grande efficacité de la

séparation

X. Bataille - ENCPB - 2008

Comparaison CPG-CLHPCPG: Chromatographie en Phase

Gazeuse : ?composés volatils,

?faibles masses molairesCLHP: ?toutes molécules trouvent un solvant pour y être dissoutes : méthode universelle

X. Bataille - ENCPB - 2008

Exemple de chromatogramme

Rétention

différée

X. Bataille - ENCPB - 2008

Performance - EfficacitéNombre de plateaux théoriquesN> 2000 2 2 0 1/2

16 5,54

r r tht tNw w( ) ( )

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Résolution

R ~ 1,5

0 0 1/2 1/2

2 1,18

A B A BA B A Br r r rt t t tRw w w w

X. Bataille - ENCPB - 2008Asymétrie

As = A/B

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Autres paramètres

Temps de rétention réduit : t"

R= t R- t 0

Facteur de capacité :

00 2 2tttk R- 00 1 1tttk R-

X. Bataille - ENCPB - 2008

Temps mort (t

mou t 0) Temps que met un produit pour traverser la colonne

sans être retenu.Se calcule si on connaît la porositéde la colonne, définie par :Le temps mortdépend des caractéristiques de la colonne: la longueur(l), son diamètre(2r), sa porosité(e) et du débitimposé par la pompe (d).

3 -1

éluant

m 2 2 colonne vide / cm .min /min

ε = / cm

π /cm´=´ ´V

d t V l r 2 m l r t d

X. Bataille - ENCPB - 2008

Autres paramètres

Sélectivité :Sous réserve de certaines approximations : NkkR S -=1""1 41aa
,,12RRtt= a

X. Bataille - ENCPB - 2008Objectif

Séparation individuelle de tous les

constituants d"un mélangeDeux facteurs :?Miscibilité dans la phase mobile ?Interaction (affinité) avec la phase stationnaire

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Principe d"une

séparation

Temps d"analyse:

minimalPerformance: maximale

Constitution de la chaîne

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Les pompes

Délivrer un débit

constantsous une pressionélevée, constante

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Vanne d"injection

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Boucle d"injection

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Colonnes

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Détecteur UV

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Détecteur UV

X. Bataille - ENCPB - 2008Détecteur

réfractométrique

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Détecteur fluorimétrique

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Constitution de la

colonne Colonne remplie de billesBilles de silice tapissées d"un revêtement

X. Bataille - ENCPB - 2008Billes

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Phase inverse (RP)

/ phase normale

Complémentarité

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Physico-chimie

de la rétentionCompromis entre:?phase stationnaire ?phase mobile

Interactions intermoléculaires

EI Q EI Q

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Interactions

intermoléculaires

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Moment dipolaire

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Autres moments

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Interaction dipôle-dipôle

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Interaction dipôle-dipôle

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Polarisabilité

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Interaction dipôle

permanent-dipôle induit

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Dispersion

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Interactions

de Van der Waals

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Liaison hydrogène

X. Bataille - ENCPB - 2008Bilan

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X. Bataille - ENCPB - 2008

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" Magic » LogP octanol/eau

Constante de partage octanol / eau

i,octanol i i,eau

P = C

C OH HO H HO H HO H HO H HO H H OH HO H HO H HO H HO H HO H H OH HO H HO H HO H HO H HO H H OH OH OH OH OH OH OH OH OH?

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Version Chemsketch

(ACDLABS)

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LogP par la méthode de Villar

(Int. J. Quantum Chem., 44444444, 203 (1992))

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LogP / Villar en PM3

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LogP par la méthode Ghose, Pritchett et Crippen (J. Computational Chem., 9999, 80 (1988))

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Influence de la polarité

de l"éluantNotion de force éluante : ?Influence de la proportion de solvant apolaire

Isothermes de van"t Hoff

i i i i ln k" ln + +

H SRT R

f

D ° D °

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Préparation d"une séparation

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Choix de l"éluant

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Gradient d"éluant

X. Bataille - ENCPB - 2008

Gradient

d"éluant

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X. Bataille - ENCPB - 2008

X. Bataille - ENCPB - 2008Couplages

Identifier les produits sortants par : ?Spectrométrie de masse ?Résonance magnétique nucléaire ?Spectroscopie Infra-Rouge

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Couplage CLHP-SM

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Couplage CLHP-RMN

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Couplage CLHP-IR

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Optimisation d"une

séparation tanalyse le plus petit possible

Résolution: 1,7 > R > 1,4Asymétrie: centrée sur 1PerformanceélevéeRobustesse : une légère modification

des paramètres ne doit pas influer sur la qualité de la séparation et de l"analyse.

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Facteurs d"optimisation Colonne (longueur, diamètre, particules, chaîne alkyle)Débit - PressionEluant (%polaire-apolaire, pH)Température

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Efficacité

Débit

Anisotropie

d"écoulement

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Van-Deemter / Knox

Hauteur Equivalente en Plateaux

Théoriques :

NLH= 3

Van Deemter : .Knox : . .

VD VD VD Kn

Kn KnB

H A C v

v

BH A v C vv= + +

X. Bataille - ENCPB - 2008

Efficacité d"une colonne (nombre de plateaux

théorique):Efficacité réelle (nombre de plateaux efficace) : avec 222

1654,5)

wdsRRRtttN222"16"54,5") wdsRRR efftttN 0 "ttt RR-

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Perte de charge

X. Bataille - ENCPB - 2008

Exemple : optimisation

de la séparation des bases de l"ADN

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Stabilisation

X. Bataille - ENCPB - 2008

Choix judicieux des

concentrations

X. Bataille - ENCPB - 2008

Spectre UV-visible

X. Bataille - ENCPB - 2008

X. Bataille - ENCPB - 2008Débit

X. Bataille - ENCPB - 2008% MeOH

X. Bataille - ENCPB - 2008

pH

X. Bataille - ENCPB - 2008

Température

X. Bataille - ENCPB - 2008Bilan

X. Bataille - ENCPB - 2008

Bilan de l"optimisation

X. Bataille - ENCPB - 2008

Applications de la CLHP

AnalytiqueCLHP Analytique ?Gamme d"étalonnage

?Ajouts dosés ?Etalon interneCLHP préparative?Dérivation en sortie ?Boucle d"injection à gros volumequotesdbs_dbs16.pdfusesText_22
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