[PDF] Persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro

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Anses - Laboratoire de sécurité des aliments - Unité SEL - Equipe Listeria

14 rue Pierre et Marie Curie - 94701 Maisons-Alfort cedex

T H È S E

pour obtenir le grade de docteur délivré par

L"Université Paris Est

et

L"Ecole Doctorale ABIES

Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé

Présentée et soutenue publiquement par

Anaïs OVERNEY

Le 9 décembre 2016

Persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires : influence de facteurs environnementaux et étude des mécanismes d"adaptation aux stress

Directeur de thèse : Mme Brigitte CARPENTIER

Co-directeur de thèse : M. Jean-Christophe AUGUSTIN

Encadrant : M. Olivier FIRMESSE

Jury M. Frédéric CARLIN, Directeur de Recherche, INRA, Avignon, France Rapporteur

M. Pascal PIVETEAU, Maître de Conférences, INRA/Université de Bourgogne, Dijon, France Rapporteur

M. Romain BRIANDET, Directeur de Recherche, INRA/AgroParisTech, Massy, France Examinateur

M. Eric METTLER, Soredab, France Examinateur

Mme Christine FAILLE, Directeur de Recherche, INRA, Villeneuve d"Ascq, France Invité Mme Brigitte CARPENTIER, Directeur de Recherche, Anses, Maisons-Alfort, France Invité M. Jean-Christophe AUGUSTIN, Professeur, ENVA/Anses, Maisons-Alfort, France Co-directeur M. Olivier FIRMESSE, Ingénieur d"Etude, Anses, Maisons-Alfort, France Encadrant 1 2 3 5

RESUME

La capacité de Listeria monocytogenes à adhérer et à persister sur les surfaces dans les ateliers

agro-alimentaires pendant de longues périodes malgré l"application correcte et fréquente des

opérations de nettoyage & désinfection (N&D), peut être responsable de la contamination

croisée de produits alimentaires par simple contact avec une surface contaminée. De plus, il est

important de prendre en considération la présence potentielle de bactéries viables non

cultivables (VNC) qui ne sont pas détectées par les méthodes culturales utilisées lors de la

recherche de L. monocytogenes dans un prélèvement de surface.

Un des objectifs a été de vérifier si les milieux de culture conventionnels fréquemment

utilisés pour les expérimentations en laboratoire étaient représentatifs des conditions

environnementales des ateliers agro-alimentaires et de définir pour la suite des expérimentations un milieu synthétique pouvant modéliser une souillure alimentaire. Pour

assurer la sécurité sanitaire des aliments et préserver la santé des consommateurs, optimiser les

opérations d"hygiène est une nécessité. Dans ce but, la survie des cellules adhérentes de

L. monocytogenes soumises à des conditions simulant en laboratoire l"alternance des phases de

N&D et de production a été étudiée. Plusieurs facteurs pouvant influencer la survie de ces

cellules ont été pris en considération et combinés par un plan d"expériences fractionnaire : la

souillure alimentaire, la souche de L. monocytogenes, le matériau de surface, la présence d"une

souche de Pseudomonas fluorescens qui favorise l"adhésion de L. monocytogenes et le scénario

de l"opération d"hygiène. Dans les industries agro-alimentaires, les bactéries sont soumises à

de nombreux stress, nécessitant pour survivre l"expression et l"induction appropriées de gènes

et de protéines de réponse aux stress. Les mécanismes de réponse aux stress mis en place par

les cellules adhérentes de L. monocytogenes après stress hydrique (dessiccation), stress

chimique (N&D) et stress froid ont été déterminés par une analyse transcriptomique.

Selon les critères étudiés (croissance, forces d"adhésion, distribution spatiale et état

physiologique des cellules adhérentes), il s"avère que le milieu TSB/5 m peut modéliser le jus de saumon fumé. Au contraire, aucun des milieux synthétiques testés ne permet de remplacer l"utilisation de l"exsudat de viande pour mimer les conditions de terrain. Concernant les facteurs influençant la survie de L. monocytogenes, les opérations d"hygiène impactent uniquement la

cultivabilité des cellules adhérentes ; toutefois, le séchage des surfaces permet une optimisation

de l"efficacité de la procédure de N&D, d"autant plus lorsqu"il est réalisé quotidiennement.

Mots-clés : Listeria monocytogenes, persistance, nettoyage & désinfection, séchage, adaptation

aux stress, viable non cultivable 6

ABSTRACT

Despite the correct and frequent application of cleaning & disinfection (C&D), Listeria monocytogenes has the ability to adhere to and persist on surfaces in food processing plants for long periods. Consequently, L. monocytogenes may be responsible for cross-contamination of food through contact with contaminated surfaces. In addition, it is important to consider the potential presence of viable but non culturable (VBNC) bacteria that are not detected by the microbiological methods used in the research of L. monocytogenes in a surface sample. One aim was to verify whether the conventional culture media commonly used for laboratory experiments were representative of the environmental conditions of food processing plants and define for further experiments a synthetic medium that can model a food soil. Optimization of the C&D procedures is necessary to ensure food safety and protect the health of consumers. For this purpose, the survival of L. monocytogenes adherent cells subjected to laboratory conditions simulating alternating phases of C&D and production was studied. Several factors that may influence the survival of these cells were considered and combined with a fractional factorial design, including: the food soil, the strain of L. monocytogenes, the surface material, the presence of a strain of Pseudomonas fluorescens, which enhances the adhesion of L. monocytogenes, and the scenario of the sanitation procedure. Moreover, in the food industry, bacteria can be subjected to many stresses; thus, the expression and induction of appropriate genes and stress response proteins are required for survival. The stress response mechanisms set up by the adherent L. monocytogenes cells after hydric stress (i.e. desiccation), chemical stress (i.e. C&D), and cold stress were determined by a transcriptomic analysis.

According to the criteria studied (i.e. growth, adhesion forces, spatial distribution, and

physiological state of adherent cells), TSB/5 m medium was found to be a sufficient model for smoked salmon juice. In contrast, none of the tested synthetic media can replace the use of meat exudate to mimic field conditions. About the factors influencing the survival of L. monocytogenes, C&D procedures were found to only impact the culturability of adherent cells; however, drying surfaces were found to optimize the effectiveness of the C&D procedures, especially when performed daily.

Keywords

: Listeria monocytogenes, persistence, cleaning & disinfection, drying, stress adaptation, viable but non culturable 7

REMERCIEMENTS

Bien que cette page soit la première d"un mémoire de thèse, c"est souvent la dernière et

probablement la plus difficile à écrire, la difficulté résidant dans le désir et le devoir de n"oublier

aucune des personnes ayant contribué, de près ou de loin, à la réalisation de ce travail. La

rédaction des remerciements, symbole de l"accomplissement et de la conclusion d"une aventure humaine et scientifique, fait remonter à la surface des souvenirs et des anecdotes. Fruit d"une graine plantée il y a déjà trois ans, ce mémoire récapitule un travail qui n"aurait pu aboutir sans l"aide de nombreuses personnes que je remercie sincèrement :

Frédéric CARLIN et Pascal PIVETEAU pour le temps consacré à l"évaluation de ce travail en

tant que rapporteurs de la thèse, Romain BRIANDET, Christine FAILLE et Eric METTLER pour leur participation à la soutenance de la thèse en tant que membres du jury, Laurent LALOUX, Michel-Yves MISTOU, Renaud LAILLER, David ALBERT et Sophie

ROUSSEL pour l"accueil qu"ils m"ont réservé au sein du Laboratoire de sécurité des aliments

de l"Agence et plus particulièrement dans l"unité Salmonella, E. coli et Listeria du département

de microbiologie, Jean-Christophe AUGUSTIN, Mickaël DESVAUX, Christine FAILLE, Cosette GRANVALET et Colin TINSLEY, membres du comité de la thèse, pour leurs conseils avisés,

Brigitte CARPENTIER, à qui j"ai pensé chaque jour de cette thèse, pour m"avoir donné

l"occasion d"intégrer une équipe pleine de valeurs humaines et m"avoir fait confiance pour la réalisation de cette thèse, Jean-Christophe AUGUSTIN pour avoir accepté de prendre le flambeau de la direction de la thèse,

Olivier FIRMESSE "juste" pour avoir persisté à mes côtés pour m"épauler dans ce projet,

Laurent GUILLIER pour son aide qui a significativement fait la différence, inutile de le

démontrer statistiquement, tous les modèles mathématiques corroborent cette hypothèse, Danielle CHASSAING pour son accueil à bras ouverts au laboratoire, son implication à me former avec rigueur, son oreille attentive et sa gentillesse qui ont été autant d"éléments m"ayant permis d"atteindre les objectifs fixés, Patricia NG pour son investissement dans mon travail de thèse mais aussi pour toutes ses délicates attentions qui ont rendu mon quotidien plus doux et agréable, 8 Léa BENMAGHNIA pour sa générosité et son organisation sans faille pour m"approvisionner en vaisselle propre et ce, toujours avec ce sourire qui a égayé mes journées, Joséphine JACQUES-ANDRE-COQUIN et Lena FRITSCH, deux stagiaires que j"ai eu

l"occasion de former et d"encadrer, pour avoir enrichi chacune à leur manière cette expérience

humaine, Meryl VILA NOVA et Kévin DURIMEL pour leur implication et leur motivation

incontestables à me faire voyager dans l"univers de la bioinformatique, monde parallèle

m"ayant permis d"illustrer la dernière partie de ce manuscrit, Graziella MIDELET-BOURDIN et Thomas BRAUGE pour leur soutien, même à distance, tout au long de ces trois années de thèse, Sabine DELANNOY pour ses nombreux conseils scientifiques mais pas seulement ... Clémentine HENRI et Benjamin GLASSET pour les moments partagés et l"amitié nouée, Ainsi que tous les membres de l"équipe Listeria et plus globalement toutes les personnes du laboratoire avec qui j"ai eu l"occasion d"échanger. Enfin, ces remerciements ne seraient pas complets sans une pensée particulière à :

Mes parents qui m"ont fait grandir à l"abri de tout souci affectif et qui m"ont offert ce luxe inouï

de faire aujourd"hui ce qui m"épanouit, mais ces quelques mots ne pourront pas suffire à exprimer toute ma reconnaissance alors j"ajouterai seulement que cette thèse est un peu la leur aussi, Et Nicolas, mon compagnon de chaque jour, notre couple a mûri avec mon projet professionnel, le premier servant de socle solide à l"épanouissement du second.

Non sans émotion, j"ai rédigé ces remerciements qui clôturent l"écriture de ce manuscrit ainsi

que ce chapitre de ma vie. J"espère que ceux que j"aurais eu l"indélicatesse d"oublier sauront me pardonner ... " Soyons reconnaissants aux personnes qui nous donnent du bonheur ; elles sont les charmants jardiniers par qui nos âmes sont fleuries. »

Marcel Proust

9

TABLE DES MATIERES

PREAMBULE .......................................................................................................................... 23

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................................ 27

CHAPITRE 1 : Listeria monocytogenes ........................................................................................... 29

1. Listeria monocytogenes : taxonomie et caractéristiques ........................................................... 29

1.1. Taxonomie ......................................................................................................................... 29

1.2. Les caractéristiques phénotypiques.................................................................................... 30

1.3. L. monocytogenes : un germe ubiquitaire .......................................................................... 30

2. La listériose : une maladie atypique .......................................................................................... 31

2.1. Physiopathologie ................................................................................................................ 31

2.2. Epidémiologie .................................................................................................................... 32

CHAPITRE 2 : Présence de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires ................ 37

1. Formation de biofilms sur les surfaces ...................................................................................... 37

1.1. Définition ........................................................................................................................... 37

1.2. Processus de formation de biofilms ................................................................................... 37

1.3. Les facteurs impliqués dans la formation de biofilms ....................................................... 40

1.4. Les propriétés particulières des cellules adhérentes .......................................................... 44

2. Moyens de lutte contre l"implantation de biofilms dans les ateliers agro-alimentaires ............ 44

2.1. Les procédures de nettoyage & désinfection ..................................................................... 45

2.2. Les méthodes alternatives .................................................................................................. 55

2.3. Une étape supplémentaire : le séchage des surfaces .......................................................... 58

2.4. Les paramètres influençant l"efficacité des opérations d"hygiène ..................................... 58

3. La persistance au sein des ateliers agro-alimentaires ................................................................ 62

3.1. La persistance de L. monocytogenes : une évidence .......................................................... 62

3.2. Plusieurs hypothèses pour expliquer la persistance ........................................................... 63

3.3. De nombreuses études pour tenter d"expliquer et comprendre la persistance ................... 66

3.4. Lutter contre la persistance : une nécessité ........................................................................ 68

CHAPITRE 3 : Adaptation de Listeria monocytogenes aux stress rencontrés dans les ateliers agro-

alimentaires ....................................................................................................................................... 71

1. L. monocytogenes : une bactérie aux nombreuses capacités d"adaptation ................................ 71

2. Compréhension des mécanismes d"adaptation aux stress ......................................................... 72

2.1. Plusieurs méthodes pour l"étude des mécanismes d"adaptation aux stress ........................ 72

2.2. Etude des mécanismes d"adaptation à différents stress ..................................................... 73

2.3. Protection croisée ............................................................................................................... 82

2.4. Adaptation aux stress et virulence ..................................................................................... 83

3. Etat viable non cultivable .......................................................................................................... 84

3.1. Qu"est-ce que l"état viable non cultivable ? ....................................................................... 84

10

3.2. Les bactéries viables non cultivables peuvent-elles retrouver leur cultivabilité ? ............. 85

3.3. Quelles sont les méthodes de détection des bactéries viables non cultivables ? ................ 85

3.4. Un problème de sécurité sanitaire ...................................................................................... 89

ETUDES EXPERIMENTALES .............................................................................................. 91

Démarche expérimentale ................................................................................................................... 93

CHAPITRE 1 : Recherche de milieux de culture modélisant des souillures alimentaires pour étudier

le comportement de Listeria monocytogenes sur les surfaces en acier inoxydable ........................... 95

1. Contexte et objectifs .................................................................................................................. 95

2. Matériels et méthodes ................................................................................................................ 97

2.1. Souches et conditions de culture ........................................................................................ 97

2.2. Préparation des souillures alimentaires et des milieux de culture modèles ....................... 97

2.3. Croissance bactérienne ...................................................................................................... 99

2.4. Etude des populations adhérentes ...................................................................................... 99

2.5. Analyses statistiques ........................................................................................................ 103

3. Résultats .................................................................................................................................. 104

3.1. Etude des cellules de L. monocytogenes adhérentes sur l"acier inoxydable en présence de

jus de saumon fumé ou d"exsudat de viande ...................................................................... 104

3.2. Comparaison du comportement des cellules de L. monocytogenes adhérentes cultivées avec

du jus de saumon fumé ou de milieux synthétiques ........................................................... 108

3.3. Comparaison du comportement des cellules de L. monocytogenes adhérentes cultivées en

présence d"exsudat de viande ou de milieux synthétiques ................................................. 112

4. Discussion ............................................................................................................................... 114

4.1. Caractérisation du comportement de L. monocytogenes en présence de souillures

alimentaires ........................................................................................................................ 114

4.2. Recherche de milieux de culture modèles ....................................................................... 115

5. Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 118

6. Publication dans International Journal of Food Microbiology ............................................... 120

CHAPITRE 2 : Etude de facteurs environnementaux pouvant influencer la survie et la persistance de

Listeria monocytogenes sur les surfaces ......................................................................................... 131

1. Contexte et objectifs ................................................................................................................ 131

2. Matériels et méthodes .............................................................................................................. 134

2.1. Souches ............................................................................................................................ 134

2.2. Milieux de culture ............................................................................................................ 135

2.3. Sélection de produits et de protocoles de N&D ............................................................... 135

2.4. Réalisation de biofilms .................................................................................................... 137

2.5. Méthodes de décrochement des cellules .......................................................................... 142

2.6. Quantification des cellules selon leur état physiologique ................................................ 142

2.7. Réalisation d"un plan d"expériences fractionnaire pour l"étude de facteurs

environnementaux pouvant influencer la survie des cellules de L. monocytogenes ........... 143

2.8. Analyses statistiques ........................................................................................................ 147

11

3. Résultats .................................................................................................................................. 150

3.1. Sélection des souches favorisant l"adhésion de L. monocytogenes ................................. 150

3.2. Test d"efficacité des protocoles de N&D ......................................................................... 153

3.3. Obtention de cellules survivantes sur acier inoxydable ................................................... 155

3.4. Sélection de la méthode de décrochement des cellules.................................................... 156

3.5. Etat physiologique des cellules adhérentes résiduelles lors de la simulation des conditions

rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires pendant une semaine ................................ 157

3.6. Impact de facteurs environnementaux étudiés par un plan d"expériences fractionnaire.. 158

4. Discussion ............................................................................................................................... 164

4.1. Recherche de souches favorisant l"adhésion de L. monocytogenes ................................. 164

4.2. Efficacité des protocoles de N&D et obtention de populations survivantes .................... 165

4.3. Choix de la méthode de décrochement des cellules adhérentes ....................................... 166

4.4. Etat physiologique des cellules adhérentes après simulation des conditions rencontrées

dans les ateliers agro-alimentaires pendant une semaine ................................................... 167

4.5. Etude de l"impact de facteurs environnementaux sur la survie de L. monocytogenes ..... 168

5. Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 173

5.1. Etudier les interactions entre les espèces bactériennes .................................................... 173

5.2. Compléter le plan d"expériences fractionnaire ................................................................ 174

5.3. Adaptation aux stress ....................................................................................................... 176

6. Soumission dans International Journal of Food Microbiology .............................................. 177

CHAPITRE 3 : Etude des mécanismes de réponse aux stress par une approche transcriptomique 201

1. Contexte et objectifs ................................................................................................................ 201

2. Matériels et méthodes .............................................................................................................. 202

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