[PDF] Quantification des acides nucléiques par PCR quantitative en temps

View - Download Quantification des acides nucléiques par PCR quantitative en temps

Previous PDF

Next PDF

Quantification des acides nucléiques

par PCR quantitative en temps réel

C. Tse

J. Capeau

Hôpital Tenon,

Laboratoire de biochimie

et d"hormonologie,

4, rue de la Chine, 75020 Paris

Article reçu le 5 novembre 2002,

accepté le 26 novembre 2002 Résumé.La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est devenue un outil essentiel en biologie moléculaire et son application à la détection des acides et le nombre croissant des applications quantitatives de la PCR a contribué au bref rappel portant sur les bases mathématiques de la PCR, les principes de base nucléiques (chimie SYBRTM Green I et chimies utilisant les sondes fluorogéni- ques, sondes TaqMan TM , sondes FRET en tandem et sondes Beacon TM ). Elle discute des différentes stratégies de quantification et compare les systèmes de PCR quantitative en temps réel actuellement en compétition sur le marché. Les principales applications en biologie médicale sont également décrites. Mots clés :PCR, PCR en temps réel, cycle seuil, sonde fluorogénique Summary.The polymerase chain reaction (PCR) has become an essential tool rapidly evolved over the last few years and the growing interest in quantitative applications of the PCR has favoured the development of real-time quantitative the basic principles of real-time PCR with the introduction of the concept of simplify the protocols used for the detection of specific nucleic acids. We focus on the actual four technologies that enable sequence detection in a closed tube and that are SYBRTM

Green I, TaqMan

TM probes, Hybridization probes and

Molecular Beacon

TM probes. We then discuss the different quantification stra- tegies in real time PCR and compare the competiting instruments on the market. The most important real-time PCR applications in clinical biology are also described. Key words:PCR, real time PCR, threshold cycle, fluorogenic probe Le concept technologique de la réaction de polymérisation en chaîne(polymerase chain reaction ou PCR), découvert chimie en 1993, est aujourd"hui devenu un outil quasiment universel dans le domaine de la biologie. La PCR est une

méthodologie hautement sensible et spécifique pour la dé-tectiondesacidesnucléiques.Sonusages"estconsidérable-

ment étendu à de nombreuses applications, dont l"analyse quantitative d"acides nucléiques spécifiques (ADN et

ADNc) dans un échantillon donné.

Les premières approches de quantification de gènes par PCR ou de transcrits géniques par rétrotranscription PCR (RT-PCR) ont reposé sur une analyse de titration faisant

appel à l"utilisation d"une solution titrée d"acide nucléiqueTirés à part :C. Tserevue généraleabc

Ann Biol Clin 2003, 61 : 279-93

Ann Biol Clin, vol. 61, n° 3, mai-juin 2003

279
(ou standard externe) servant à l"élaboration d"une gamme d"étalonnage obtenue par dilutions en série du standard externe [2]. Le résultat de l"analyse donne une évaluation de la quantité relative de matrice cible par rapport au standard. Cependant, la précision des résultats obtenus est très souvent limitée, du fait de la grande variabilité d"effi- cacité d"une PCR à l"autre. L"introduction d"un standard interne coamplifié au cours de la même réaction PCR a permis de corriger en partie la variabilité tube à tube et a tes de quantification : celles par PCR différentielle et celles par PCR compétitive. différentielle [3], une séquence endogène, c"est-à-dire ap- partenant à un gène dit de référence présent dans l"échan- tillon testé (séquence endogène d"un gène présent à l"état d"une seule copie par génome haploïde ou transcrit d"un pendante de l"environnement extracellulaire), sert de stan- dard interne. La séquence endogène standard est coampli- fiée avec la séquence cible au cours d"une même réaction PCR utilisant deux couples d"amorces spécifiques. La mé- rapport au gène de référence, ce dernier permettant de normaliser la quantité et la qualité d"acide nucléique ex- trait. Néanmoins, la quantification à l"aide d"un gène endo- gène comme standard interne nécessite des conditions d"application extrêmement normalisées afin de s"assurer que l"amplification des deux séquences différentes (gène cible et gène de référence) s"effectue avec des efficacités identiques. Les approches de quantification par PCR (ou par RT-PCR) compétitive utilisent une séquence exogène comme stan- dard interne [4]. Ce type d"approche repose sur une coam- plification compétitive de la séquence cible avec des quan- tités connues de standard interne et en présence du même couple d"amorces. Le standard interne (ou compétiteur) est une séquence exogène d"ADN ou d"ARN synthétique que l"on construit de façon à être la plus proche possible de la séquence cible à quantifier, qui doit partager les mêmes sites d"amorçage que la séquence cible, qui doit être ampli- la séquence cible et dont le produit d"amplification doit cependant pouvoir en être différencié [5]. La quantification s"effectue par comparaison du signal PCR correspondant au gène cible avec ceux qui sont obtenus pour chaque concentration du gène compétiteur. Cependant, le choix du compétiteur et la validation des efficacités d"amplification sont difficiles à établir et relativement laborieux. L"autre limite des techniques de PCR compétitive est la nécessité decoamplifierparéchantillon,aumoins4ou5 dilutionsdu standard interne pour couvrir le domaine des concentra-

tions attendues en gène cible.Le nombre élevé de stratégies de quantification proposées

dans la littérature reflète bien la difficulté à obtenir des résultats fiables et reproductibles. L"introduction d"une molécule reporter fluorescente dans le milieu réactionnel de PCR et la détection des produits de PCR par une mé- thode fluorimétrique a conduit au développement récent des techniques de PCR quantitative en temps réel [6]. Ces des produits de PCR formés, mais sur une analyse de la cinétique de la réaction PCR au moyen d"un système capa- ble de détecter " en tube fermé » les produits de PCR formés après chaque cycle d"amplification.

Principe de la PCR quantitativeen temps réel

Les bases mathématiques de la réaction PCR : rappels Nature exponentielle de la réaction PCRLaPCRestpardéfinitionuneréactionenchaîneaucoursde laquelle les produits issus d"un cycle d"amplification ser- vent de matrice pour le cycle suivant. Ainsi, la réaction en chaîne qui s"établit par la répétition des cycles de lation exponentielle théorique de 2 n fois par molécule d"ADN. Autrement dit, la quantité de produits de PCR double à chaque cycle d"amplification suivant la relation mathématique suivante : N=N 0 .2 n (où :Nestlenombredemoléculesamplifiéesaufinal,N 0 le nombre initial de molécules et n le nombre de cycles d"amplification).

Efficacité d"amplification

Au niveau expérimental, la quantité de produit formé dé- pend d"un facteur primordial qui est l"efficacité d"amplifi- cation (E) définie comme étant la proportion moyenne des molécules d"ADN cible se dupliquant à chaque cycle d"amplification. L"efficacité d"amplification est comprise entre 0 (aucune amplification ne s"est produite) et 1 (après chaque cycle PCR, chaque molécule d"ADN cible a généré deux amplicons). Dans les conditions expérimentales habi- tuelles, E est inférieureà1etvarie entre 0,78 et 0,97 selon le gène amplifié [7]. L"introduction de ce facteur essentiel, de molécules amplifiées après n cycles d"amplification conduit à l"équation suivante : N=N 0. (1+E) n Convertie sous forme logarithmique, cette équation a pour expression :

Log N = Log N

0 +n.Log(1+E) revue générale

Ann Biol Clin, vol. 61, n° 3, mai-juin 2003280

La représentation graphique des variations du logarithme du nombre N de molécules amplifiées (Log N) en fonction du nombre de cycles d"amplification (n) est une droite dont la pente est Log (1 + E) et l"ordonnée à l"origine le nombre initialdemolécules(N 0 ).IlestalorspossibledecalculerE : E=10 - 1/pente puis d"en déduire le nombre initial de molécules N 0 .De nombreux facteurs expérimentaux (concentrations en dé- 2 etenADN polymérase, température, structure secondaire et contenu en bases G/C de la séquence cible, longueur du fragment à amplifier, présence d"inhibiteurs de l"ADN polymérase ouquotesdbs_dbs4.pdfusesText_8

[PDF] stupeur et tremblements analyse

[PDF] pcr test

[PDF] principe de conservation de l'énergie 1ere s controle

[PDF] stupeur et tremblement autobiographie

[PDF] formes et conservation de l'énergie 1s exercice

[PDF] yumimoto

[PDF] controle conservation de l energie

[PDF] étude de stupeur et tremblements

[PDF] themes stupeur et tremblements

[PDF] stupeur et tremblement pdf

[PDF] télécharger le principe de dilbert

[PDF] dilbert français pdf

[PDF] principe de dilbert citation

[PDF] la question des ressources alimentaires 5ème

[PDF] le principe de dilbert pdf