[PDF] TD 1 : Les différents types de milieux de culture.

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Dr. Khadir Abdelmounaim,

TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 1

TD 1 : Les différents types de

milieux de culture.

Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des microorganismes peuvent se multiplier,

du microorganisme

étudié.

On classe les milieux de culture :

1. Selon leur consistance :

) Milieu liquide : par un trouble ou des dépôts et des voiles superficiels. Exemple : bouillon nutritif BN, Bouillon trypticase soja (TSB), Brain-Heart Infusion Broth

) Milieu solide : On obtient les milieux solides en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide.

Le gélifiant le plus utilisé est -agar

60 °C tout en étant liquéfiable par ébullition, auquel cas, il reste en surfusion (liqui

Les milieux solides contenant généralement 1.5-2% (15-20 g.L-1 en tubes à essai, culot en tube droit ou couche mince en boites de pétri. la croissance des microorganismes se traduit par la formation des colonies exemple Gélose nutritive GN, Gélose trypticase soja (TSA), gélose Mac Conkey,

Gélose Muller-Hinton etc.

) Milieu semi-solide : contenant 0.5-0.75 (5-7,5 g.L-1hugh et Leifson, viande

2. Selon leur composition :

) On distingue 2 types de milieux : ) Les milieux complexes ou empiriques : De composition complexe, mal définie, ils peuvent être -d'origine animale : lait, sérum, bouillon et gélose nutritive, gélatine, etc. Tryptycase soja, gélose au Chocolat, gélose au sang, etc.

) Les milieux synthétiques ou définis : dans lesquels tous les composants sont connus

uelques-uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen,

Urée-Tryptophane.

3. Selon leur utilisation : On distingue en général 4 types principaux de milieux :

A- Milieux de-base ; appelés aussi milieux usuels non sélectifs, on regroupe sous ce vocable tous les

milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont en général de préparation assez simple et

généralement peu coûteuse, ces milieux contiennent une base nutritive constituée de molécules azotées

(acides aminés, molécules organiques de de produit vivante

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(animale, végétale, mycélienne) comme les peptones, les extraits de viande ou de levure exemple gélose et

Bouillon nutritif, gélose et Bouillon Muller-Hinton .

B- Milieux d'isolement ; ils peuvent être, suivant les techniques envisagées et les bactéries en cause

soit ;

Des milieux non sélectifs enrichis ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des

liquides ou suspensions riches en molécules organiques diverses : du sang, d

améliorées par dénaturation thermique des constituants, en particulier pour le sang. Ils permettent la

pousse de nombreux germes exigeants ou très exigeants. Les plus utilisées sont les géloses au sang frais

au milieu de base peut avoir plusieurs buts : apporter des facteurs de croissance nécessaire au micro-

organisme étudié.

Des milieux sélectifs, destinés à favoriser la croissance d'une ou plusieurs espèces bactériennes

-organismes. Pour cela on ajoute des éléments qui

inhibent la croissance des micro-organismes indésirables comme le chlorure de sodium à forte

concentration, le thiosulfate de sodium, le cristal violet ou certains antibiotiques, etc.Les éléments

ajoutés sont sélectionnés selon les caractéristiques du micro-organisme recherché. Ces milieux sont

utilisés pour l'analyse d'un prélèvement polybactérien.

Exemples de milieux sélectifs :

milieu S-S : il ne permet la croissance que des Salmonelles (Shigella s'y développe moins vite : environ 48 à 72 heures avant d'obtenir une culture exploitable). Milieu de Sabouraud : il permet la pousse des mycètes (Candida). gélose Kanamycine - Vancomycine, dite "Kana-Vanco" ou KV : elle empêche la pousse des

bactéries à Gram positif (action de la vancomycine) et de la plupart des entérobactéries (action de

la Kanamycine). Sur ce milieu, poussent préférentiellement des bactéries anaérobies strictes.

Milieux différentiels

Le milieu de culture dit différentiel ou milieu d'identification indicateur permet de distinguer deux types

de microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu met en évidence certaines

caractéristiques biochimiques des microorganismes (principalement l'aptitude à dégrader un substrat)

en présence d'indicateur(s) de la réaction chimique : des indicateurs colorés de pH ou d'oxydo-réduction

(tel que le rouge neutre, rouge de phénol, l'éosine ou le bleu de méthylène).

Exemple Gélose Mac conkey : La gélose Mac Conkey est un milieu sélectif et différentiel au même

temps utilisé pour l'isolement des entérobactéries. En effet, elle contient des agents sélectifs qui

freinent le développement des bactéries à Gram positif: cristal violet et sels biliaires. Il est également

L'orientation de l'identification qui est basée sur l'utilisation du lactose,

repérable grâce à 1 indicateur de pH (rouge neutre) les colonies de E coli apparaissent en rouge, car ce

sont des lactoses + tandis que les autres colonies lac apparaissent incolores.

La Gélose Chapman (MSA), milieu sélectif des staphylocoques qui différencie la fermentation du

mannitol permettant une orientation entre autres vers Staphylococcus aureus.

Le milieu hugh et Leifson est un milieu semi-solide qui permet de déterminer la voie métabolique

empruntée par les différentes espèces bactériennes oxydative ou fermentative, il permet aussi de

déterminer "la voie d'attaque du glucose". Le milieu viande foie -solide, ce milieu est principalement utilisé dans longs

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tubes fins " tube de prévôt » pour la détermination du type respiratoire des micro-organismes, mais aussi

pour la culture de germes anaérobies stricts telles que les Clostridium).

Le Mannitol-Mobilité-Nitrate est un milieu semi-solide de culture caractérisé par l'utilisation

de mannitol et de Nitrate et permet la mise en évidence (ou non) de la mobilité bactérienne.

Milieux chromogènes ou discriminants

Ce milieu peut être sélectif ou non. Son principe repose sur la présence d'un ou plusieurs substrats (s)

couplés (s) à une molécule chromogène. Lorsque ce substrat est métabolisé par une enzyme bactérienne

spécifique, le chromogène associé prend une couleur particulière (il devient un chromophore)

directement lisible sur la colonie. Si l'enzyme n'existe que chez une espèce bactérienne donnée,

l'identification est immédiate. Exemple gélose MRSA-ID qui permet de détecter directement les souches

de Staphylococccus aureus résistantes à la méticilline.

Principaux ingrédients des milieux de cultures

Constituants Caractéristiques Fonction

Extraits de viandes.

A partir de tissus animaux sélectionnés (à froid : macération; à chaud: infusion, extraits de viandes).

Source de protéines peu

dégradées, glucides, sels minéraux, vitamines hydrosoluble. (vitamine B).

Peptone

(pancréatine, pepsine, trypsine, papaïne) sur des matières protéiques (viande, caséine, oligopeptides.

Hydrolysats

protéines. chlorhydriques sur des ions minéraux.

Agar-agar ou gélose

de polysaccharides (agarose 70% et agaropectine 30%). A 90°C se dissout dans température elle forme un gel transparent +/- solide.

Solidifier

cultures. les milieux de Produits biologiques Sang, sérum, lait, gélatine, pomme de terre, etc. molécules diverses organiques

Base minérale

Macroéléments ioniques (Na+, K+, Mg2+,

Ca2+, Cl-, PO4-2, SO4-2, HCO3-

Microéléments ioniques ou oligoéléments (Fe, Co, Ti, Zn, Cu, B, Se, Mo, V, W, Mn.)

Apportent

électrique,

osmotique, fonctionnement enzymatique.

Eau distillée.

a) Exemple 1 : gélose nutritive

Constituant Quantité Fonction

Peptone 5g

Extrait de viande 1g

Extrait de levure 2g

Chlorure de sodium 5g

Agar-agar 15g

pH final à 25°C : pH 6,8± 7

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TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 4 a) Exemple 2 : Hajna Et Kligler

Constituant Quantité Fonction

Peptone 15 g

Extrait de viande 3 g

Extrait de levure 3 g

Peptone pepsique de viande 5 g

Glucose 1 g

Lactose 10 g

Rouge de phénol 25 mg

Chlorure de sodium 5 g

Sulfate ferreux 0,2 g

Thiosulfate de sodium 0,3 g

Agar-agar 15 g

Exercice :

Un microbiologiste veut faire préparer une gélose dite de Müller-Hinton. Cependant, dans son

1) quel est cet ingrédient ?

2) Combien de grammes doit-il ajouter pour la ?

3) Parmi les constituants des milieux de culture, les extraits de levures et les peptones ;

a. Comment peut-on obtenir ces composés ? b. de quoi sont-ils constitués ?

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TD N° 02

des bactéries et croissance bactérienne

Les microorganismes coexistent en populations mélangées dans les différents environnements

de bactéries différentes

108 9 bactéries

par grammes de terre constituée de plusieurs espèces de bactéries et de champignons. Les analyses de

prélèvements pathologiques du milieu hospitalier donnent généralement des cultures polymicrobiennes.

Ceci pose un problème pour les microbiologistes, car on ne peut jamais étudier plusieurs espèces

s autres par des de base

Termes importants :

Ensemencement ou inoculation en microbiologie : introduire un inoculum bactérien dans un milieu de

culture stérile (bouillon ou gélose, ect.) À pipette Pasteur ou anse de platine, ect. Inoculum : Échantillon ou bien quantité de microorganismes mère, destinée à ensemencer (inoculé) au sein favorable à sa multiplication. : Consiste à des ensemencements sur des milieux de culture dans un but de séparation de façon à obtenir des colonies bien distinctes. Repiquage : réensemencement de culture pure dans un milieu de culture neuf.

La différence entre " Espèce » et " souche » : Une souche est une partie d'une espèce bactérienne, mais

elle est différente des autres bactéries de la même espèce par une différence mineure, mais identifiable.

1- : lon de culture: Dissociation dans un milieu liquide une colonie bactérienne Ensemencement par stries des milieux gélosés

essuie soigneusement le file de platine ou la boucle de la pipette pasteur sur la surface de la gélose cette

méthode se fait dans le cas des géloses coulées dans des boites de pétri ou bien les géloses inclinées en

tubes à essai.

Ensemencement par inondation (en nappe) : On inonde la surface du milieu gélosé en boite de pétri par

ré- antibiogramme CASFM).

Ensemencement dans la masse

-à--45°), cette méthode est utilisée pour le dénombrement bactérien.

Ensemencement par spots

millimètres de diamètres) cette technique permet de faire plusieurs essais de cultures sur la même boite

(ex tester plusieurs souches).

Ensemencement par piqure centrale : elle se fait généralement sur des tubes contenant un milieu gélosé

ensemencement du milieu mannitol-mobilité.

Ensemencement par écouvillonnage : Tremper un écouvillon stérile dans une solution ou une suspension

bactrienne puis ensemencer la surface de la gélose. (Ex. test antibiogramme CLSI).

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TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 6 2- cadrans: Cette technique permet de séparer les divers micro-organismes contenus dans le prélèvement initial.

Un isolement peut être envisagé pour: séparer des micro-organismes différents au sein d'un mélange,

purifier une souche contaminée ou contrôler sa pureté :

1- Tracer sur le fond extérieur de la boite de pétri gélosé deux diamètres perpendiculaires

divisant la boite en quatre secteurs.

2- Déposer près bord de la moitié de la boîte correspondante aux cadrans 1 et 2

3- Étaler ce dépôt en réalisant des stries très serrées dans la moitié de la boite (cadrans 1et 2).

4- 5- moitié correspondant aux quadrants 2 et 3. 6- 7- serrées dans la moitié correspondante aux quadrants 3 et 4. ecteurs ou cadrans : empiétant second. La répétition de cette procédure sur le troisième secteur.

Technique de dilution successive :

microbienne importante il en résulte une surface de la boite de pétrie pleine de colonies collées les unes

avec les autres cela empê

des dilutions du produit à analyser. Certaines analyses bactériologiques telles que le dénombrement

bactérien recommandent de faire un dénombrement lorsque la boite de pétrie et chargé avec un nombre

approximatif entre 30 et 300 colonies et donc dans le cas où on a un nombre plus important il est recommandé de faire des dilutions successives :

Une solution du produit à analyser est préparée, ensuite des tubes contenant le diluant avec un volume

de 9 ml sont préparés également (dans le cas où on veut faire des dilutions de facteur 10) un volume de

1 ml est transféré à partir du produit a analysé vers un premier tube contenant 9 ml du diluant stérile, il

en résulte une première di-1. Après pour établir une autre dilution, on prend 1 ml à

partir du tube contenant la dilution 10-1 vers un autre tube contenant 9 ml du diluant stérile, la même

procédure ce fait pour obtenir une série de dilution de facteur 10 : 10-1 10-2 10-3 10-4 ect.

3- Croissance bactérienne

Définition :

Croissance : augmentation coordonnée des constituants cellulaires, se traduisant par du nombre de cellules.

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3-1 Division bactérienne :

La bactérie se multiplie par fission binaire : la bactérie grandit puis se divise en deux cellules

se duplique ainsi que les autres constituants. Divers systèmes enzymatiques de synthèse et de

dégradation participent à la division cellulaire. Les bactéries sont des organismes asexués dont

la reproduction a lieu par division cellulaire ou reproduction binaire encore appelée scissiparité.

La reproduction se fait selon trois phases :

) Allongement de la bactérie, ) Duplication des constituants, ) Séparation

3-2 Courbe de croissance

Courbe de croissance : La croissance d'une bactérie s'étudie en milieu liquide. Il existe cinq phases dont l'ensemble constitue la courbe de croissance.

Phase de latence : le taux de croissance nul (µ = 0). La durée de cette phase dépend de l'âge

des bactéries et de la composition du milieu. C'est le temps nécessaire à la bactérie pour

synthétiser les enzymes adaptées au nouveau substrat (pas de phase de latence si repiquage sur milieu identique au précédent). Phase de de croissance exponentielle : le taux de croissance atteint un maximum (µ=max). Cette phase dure tant que la vitesse de croissance est constante. Le temps de doublement des bactéries est le plus court. La masse cellulaire est représentée par des cellules viables (mortalité nulle). Phase de ralentissement : la vitesse de croissance régresse. Il y a un épuisement du milieu de culture et une accumulation des déchets. Il existe un début d'autolyse des bactéries. . Phase maximale stationnaire : le taux de croissance devient nu (µ = 0). Les bactéries qui se multiplient compensent celles qui meurent.

Phase de déclin : le taux de croissance est négatif (µ < 0). Toutes les ressources nutritives

sont épuisées. Il y a accumulation de métabolites toxiques. Il se produit une diminution d'organismes viables et une lyse cellulaire sous l'action des enzymes protéolytiques

endogènes. Cependant, il persiste une croissance par libération de substances libérées lors de

la lyse (croissance cryptique).

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3-3 Temps de génération

Par définition, le temps de génération ou de doublement (G) est le temps requis pour le

doublement de tous les constituants bactériens. L'augmentation du nombre de cellules durant la phase exponentielle représente une progression géométrique du nombre 2. Une cellule qui se divise en deux est exprimée comme suit: 20 ĺ1. Deux cellules qui se divisent en quatre est exprimé comme allant de 21 ĺ2 et ainsi de suite. Donc la relation mathématique entre les

cellules présentes initialement et après un temps donné en phase exponentielle est: N= N0

2n, Où N représente le nombre théorique final de cellules, N0 le nombre initial et n le nombre de

générations

Effet de la température

Les bactéries peuvent être classées selon leur température optimale de croissance.

- Bactéries mésophiles (Ex. : Escherichia coli) : température de croissance proche de celle du

corps humain (37°C) - Bactéries thermophiles (Ex. : Thermus aquaticus) : températures de croissance comprises entre 45°C et 70°C. - Bactéries hyperthermophiles (Ex. : Archaea) : températures de croissance supérieures à

80°C .

- Bactéries psychrophiles (Ex. :) : Températures proches de 0°C (optimum à 10-15°C). - Bactéries psychrotrophes (Ex. : Pseudomonas) : températures de croissance proches de 0°C avec optimum de croissance proche des bactéries mésophiles.

Exercice 01 :

On veut faire le dénombrement bactérien dans un aliment solide. Pour cela, on a préparé une

dilution initiale à partir de cet aliment. dans cette dilution initiale ? expliquez.

2) Après ensemencement et incubation, on a obtenu une culture très dense (trop chargée). Quelle

est la méthode à faire à la dilution initiale pour avoir une culture moins dense dans un deuxième

ensemencement ?

1: phase de latence,

2: phase de croissance exponentielle,

3 : phase de ralentissement,

4 : phase stationnaire,

5 : phase de déclin.

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3) Quel est le nombre de bactéries recommandé pour faire le dénombrement ?

Exercice 02 :

Selon la température optimale de la croissance (figure ci-dessous),

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TD N° 3 : Identification bactérienne

1. macroscopique : Définition

solide.

Cette description doit mentionner :

La taille : diamètre des colonies. Vous pouvez mesurer cette taille à l'aide d'une règle graduée. On distingue :

¾ Colonies punctiformes : Colonies à peine visibles, dont la taille est inférieure au millimètre

¾ petites colonies : Colonies dont le diamètre est compris entre 1 et 2 mm ¾ Colonies moyennes : Colonies dont le diamètre est compris entre 3 et 5 mm ¾ Grosses colonies : Colonies dont le diamètre est supérieur à 5 mm

La vue de profil (élévation) avec

vue de dessus (bords ou contours) (bords : dentèles, en étoile, ovoïde, régulière, ondulée, lobée).

L'aspect de la surface (lisse, rugueuse, brillante). L'opacité. Les colonies opaques ne laissent pas passer la lumière contrairement aux translucides. Certaines sont très transparentes, car ils laissent passer la lumière.

La consistance. Elle se juge au moment du prélèvement. On distingue les colonies crémeuses des

sèches et des muqueuses (gluantes). La couleur ou pigmentation. La plupart des colonies isolées sur gélose ordinaire sont couleur crème (sans pigment) mais certaines sont blanc porcelaine, jaune, vert,...; Figure 1 : aspect macroscopique des colonies bactériennes

Taille et

Punctiform

Filamenteu

Irrégulière

Fusiform

Elévation

Plane Elevé

Convex

Bombé

Bossue

Bord

Régulie

Ondul Lob

Dentel

Filamenteu

Bords surélevés

Rhizoïd Circulaire

18 18 2. : bactérienne. Elle comprend : la forme et parfois la mobilité des germes étudiés.

Technique :

1. :

Déposer sur une

besoin. 2. :

Déposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau) sur la lame. Prélever une trace de culture à

2/ Après coloration :

) Préparation du frottis : ) Étalement. L'étalement doit se faire en couche mince, sur une ) Lame dégraissée. ) Séchage. Laisser sécher à l'air.

) Fixation. Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à

l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement. On peut également fixer

en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool éthylique versées directement sur le prélèvement.

) A ce stade les germes ne sont plus considérés comme contaminants.

2-1 / Coloration simple

Coloration au bleu de méthylène

Sur le frottis fixé et refroidi :

- Faire couler la solution de bleu de méthylène phéniqué jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte.

- Laisser agir 1 minute.

- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distillée, ou à l'eau du robinet jusqu'à

élimination des colorants en excès.

- Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou encore sécher délicatement entre deux feuilles de

papier filtre fin (ou buvard), sans frotter. - Examiner au microscope, objectif à immersion.

Résultats

Les bactéries sont colorées en bleu sombre.

Cette coloration est intéressante pour l'observation rapide des frottis, mais elle permet seulement l'étude de la morphologie des bactéries. Il est donc souvent nécessaire de la compléter par une coloration de Gram.

2/ Coloration différentielle

2-1. Coloration de Gram

C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne,

et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier en deux grands groupes: Gram+ qui ont une paroi de peptidoglycanes épaisse (ex : Bacillus cereus) Gram- qui ont une paroi de peptidoglycanes fine, mais ont en plus une membrane externe 19 18 ) Protocole :

1. Coloration par le violet de Gentiane ou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute.

Rincer à l'eau déminéralisée.

2. Mordançage au Lugol (solution d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 30 secondes

; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus

de sécurité.

3. Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser goutte à goutte l'alcool ou un mélange

alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet

doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée ;

4. Recoloration à la Safranine ou à la Fuchsine. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver

doucement à l'eau déminéralisée.

5. libre.

6. Examen. Observer avec une goutte d'huile à immersion objectif 100 (×1000).

Figure 2 : les différentes formes de cellules bactériennes

2-2. Coloration de Ziehl Neelsen : cette coloration est utilisée pour la recherche des bacilles tuberculeux,

elle est basée sur la capacité de ces bactéries à conserver , après coloration à chaud à la fushine , la teinte

Alcoolo-Acido-Résistants ou bacilles A.A.R .

) Le protocole : -Réaliser le frottis et le fixer -Faire agir la fuschine concentrée à chaud. -Laver soigneusement le frottis -Placer dans un -Laver -Laver Les A.A.R apparaissent roses tandis que les autres bactéries sont bleues. 20 18

2-3. Coloration de spores :

Certaines espèces bactériennes ont la propriété de se transformer en spores ex : Bacillus

de résistance de ces bactéries en particulier vis-à-vis de la chaleur , capable de redonner la forme

végétative . La coloration de spore se fait par le vert de malachite. les spores apparaissent vertes dans

les corps bactériens roses.

2.4. Coloration de capsule :

Les capsules sont des couches denses et bien délimitées de molécules visqueuses accumulées à

certaines bactéries comme les pneumocoques.

3. Identification bactérienne

est proposé. otypique utilise un faible nombre de caractères considérés comme importants tels

ect. les identifications bactériennes par les caractères biochimiques et sérologiques sont les plus utilisés

en routine. elle est basée sur les techniques de biologie moléculaire telle que la PCR chère est nécessite un matériel spécifique et un personnel qualifié.

types MALDI-TOF MS est parmi les méthodes nouvelles les plus recommandées ces dernières années

à cause de ça rapidité et sensibilité et son cout moins cher.

Exercice :

En étudiant deux bactéries différentes par microscopie électronique, un chercheur a remarqué que

la première(A) à une forme sphérique et une paroi épaisse, alors que la deuxième (B) a une forme

allongée en bâtonnet et une paroi mince avec une membrane externe.quotesdbs_dbs11.pdfusesText_17

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