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UNIVERSITE D'AIX-MARSEILLE

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE (EDSVS) ED 62

UMR 7257 CNRS

AFMB ARCHITECTURE ET FONCTION DES MACROMOLECULES BIOLOGIQUES

INNATE PHARMA

Thèse présentée pour obtenir le grade universitaire de docteur

Discipline : Biologie

Spécialité : Biochimie structurale

Jennifer ROCHE

Etudes structurales de fragments d'anticorps d'intérêt thérapeutique et biotechnologique

Soutenue le 17/10/2017 devant le jury :

Marie-Hélène LE DU - (I2BC, Gif-sur-Yvette) RAPPORTEUR Jean-Luc FERRER - (IBS/CEA, Grenoble) RAPPORTEUR Julie MENETREY - (I2BC, Gif-sur-Yvette) EXAMINATEUR James STURGIS - (LISM/IBSM, Marseille) EXAMINATEUR Laurent GAUTHIER - (INNATE PHARMA, Marseille) EXAMINATEUR Alain ROUSSEL - (AFMB, Marseille) DIRECTEUR DE THESE

Remerciements

Je voudrai

s commencer par remercier la région PACA, l'université AMU et Innate Pharma de m'avoir accordé le financement nécessaire à la ré alisation de cette thèse.

Je voudrai

s aussi remercier le laboratoire AFMB de m'avoir accueillie, depuis mes

stages de master jusqu'à la fin de ce projet de thèse. Merci donc à Yves Bourne pour tout ça.

Merci à Alain Roussel de m'avoir fait assez confiance pour me proposer ce sujet et à Sonia

Longhi de

m'avoir poussée à me lancer dans cette aventure.

Ensuite, je voudrai

s dire merci à tous les membres de l'équipe " Interaction hôte- pathogène

», passés et

présents. Vous avez été super au quotidien, chacun à votre manière. Un grand merci à Silvia Spinelli, Gerling Sulzenbacher, Philippe Canteau, Philippe Leone et Véronique Zamboni pour avoir eu la patience de me transmettre votre savoir en

cristallogenèse, pêche des cristaux, diffraction par rayons X, collecte de données etc...

J'espère vous rendre fiers !

Des remerciements spéciaux à Stéphanie Blangy et Julie Lichière, les wonderwoman du labo que je garderai toujours en mémoire Merci à tous ceux qui ont fait partie de mon quotidien, pour vos sourires et votre bonne humeur, nos discussions scienti fiques, sérieuses ou farfelues.

Maintenant les choses sérieuses...

Merci mes petites " tata/maman » : Jenny, Amandine et Béatrice. J'ai tellement appris grâce à vous... Merci à Clémentos, Marionos, Fathios, Reubenos, Matilde, Amal, Gabichou, Yoan,

Laurie et Anaïs. Vous êtes tarés (mais vraiment pas équilibrés !) mais je vous aime quand

même. Merci aussi à toute la team Danse (désolée, vous êtes beaucoup trop nombreux ^^'). Merci à tous mes correcteurs de dernière minute (Marjorie, Raphaël et Yoan), vous avez

été géniaux

Un grand merci à Marjorie, ma petite soeur de coeur, à ma soeur de sang Nathalie et mon frère Anthony.

Merci à toi John, pour cette grande leçon que tu m'as donné et que je garderai

toujours en mémoire : ne jamais baisser la tête.

Antoine, j'

ai connu avec toi les joies, espérances, déceptions, angoisses de la thèse, du milieu à sa fin. Merci de m'avoir supportée pendant tous ces moments, d'avoir su être un

rŽel p»rten»ire et enàore merài 8Õ»voir »ààeptŽ 8e me lire et àorrigerd m»lgrŽ les

àirào

nst»nàesb

Ç petites Èb

r»pi8ement ˆ se p»rlerb /»is je pense quÕ»veà àette rŽ8»àtion on » fin»lement rŽussi ˆ

xt le plus import»nt

É /erài Xolo

RRR

Ë Xierrotd

8isàret m»is toujours prŽsentd

Listedes brévi tions

ADN : Acide DésoxyriboN ucléique BLI : Bio -Layer Interferometry CD : Dichroïsme C irculaire CDR

Région Déterminante de C

omplémentarité CH : " Constant Heavy chain domain » CL : " Constant Light chain domain » CMH : Complexe Majaur d'Histocompatibilité D max : Distance maximale DO : Densité O ptique DTT : DiThioT réitol EG : Ethylène Glycol

Fab : " Fragment Antigen-Binding »

Fc : Fragment constant FPM : Force Proton Motrice GM -CSF : " Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor » HcAbs : " Heavy chain Antibodies » His -Tag : Etiquette 6xHistidine I0 : Intensité diffusée extrapolée à une valeur de vecteur diffusé de 0 Ig : Immunoglobuline IPTG : IsoPropyl -beta-D-1-ThioGalactopyranoside kass : constante de vitesse d'association KD : constante de dissociation kdiss : constante de vitesse de dissociation LGL : Grands lymphocytes à granules

Lymphoc

ytes Tc : Lymphocyte T cy totoxique

Lymphocyte

s Th

Lymphocyte T " helper »

mAbs : " monoclonal Antibodies » MMS : " Matrix Micro-Seeding » Nb : Nanobody NK : Natural Killer NKG2D " Natural Killer Group 2-member D » XMD : Ç Xolymer»se Mh»in De»àtion È

Xxê

Xê Xor/ : XrotŽine / 8e

Porphyromonas gingivalis

XXê

pXor/ : X»rtie pŽripl»smique 8e l» protŽine Xor/ pXor/ Mt : X»rtie M termin»le 8e l» protŽine pXor/ pXor/ ft : X»rtie f termin»le 8e l» protŽine pXor/ pXor/ e 8e l» protŽine pXor/ DMkq XCq

: Ç Dese»ràh Moll»7or»tory for ktruàtur»l qioinform»tiàs Xrotein C»t» q»nk È

Dg : D»yon 8e gir»tion rbmbsb8 : Ç Doot /e»n kqu»re Cevi»tion È kA9k : Ç km»ll Angle 9 r»y light kà»ttering È kCk XAêx : Ç ko8ium Co8eàyl kulf»te XolyAàryl»mi8e êel xleàtrophoresis È kxM : Ç êener»l kxMretion p»thw»y È kxM /A3k : Ç kize xxàlusion Mhrom»togr»phy with /ulti Angle 3ight kà»ttering È ke/et : kŽlŽno/Žthionine kb4bM Ç kuper 4ptim»l 7roth with M»t»7olite repression È *»t : Ç *win *MD

Ç * Mell Deàeptor È

*f' : '»àteur 8e nŽàrose tumor»le *xkk

6E : Ç 6»ri»7le Ee»vy àh»in 8om»in È

63 : Ç 6»ri»7le 3ight àh»in 8om»in È

T ble desm tières )3; !A!

3eoe3!y bgniricxLlT2LLpdricrtcxLlè2niLpdriceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeecRoê!

3eoeF!4yk4curicèéltIL ricPjhcrtcTlègrqricPjh'PjhRoceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeecRo5!

3eoe5!1éIuLTtLl icurcitédTtdéricudcTlègrqrcPjhyNDDR'PjhRocèbéculTïL 'clgITdgbLére

cRov

3eêeR!0b lxlunc xDRcrtc xDoc:crqèériiLl crtcèdéLSLTbtLl eceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeecRêD!

3eêeo!héLitbggl'ébè2LrcBctrèIébtdércbxLb trcurc xDoceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeecRêR!

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!7!

1 Introduction

1.1

Introductiongénér le:

L'environnement d'un organisme est constitué d'une multitude de micro-organismes. Ceux -ci peuvent être de différents types (bactéries, virus, levures, protozoaires ou parasites

multicellulaires) et leur interaction avec l'organisme peut être bénéfique à celui-ci comme

nocive. Dans ce second cas, ces micro-organismes peuvent entraîner des maladies par leur

propagation et prolifération, pouvant aller jusqu'à la mort de l'organisme hôte. Celui-ci doit

alors développer des stratégies de défense afin d'anticiper ou au mieux réagir aux attaques

des pathogènes.

La première ligne de défense est constituée des défenses naturelles externes. La

barrière cutanéo -muqueuse empêche la plupart de ces micro-organismes infectieux d'entrer en interaction avec l'organisme. Aussi, le lysozyme contenu dans la plupart des sécrétions,

le mucus, les sécrétions des glandes sébacées, l'acidité gastrique, des germes ou simplement

des caractéristiques physiques de l'organisme participent à l'élimination et non invasion d'agents infectie ux (1). Cependant, ceux-ci peuvent passer au travers des épithéliums des tr actus digestifs et uro -génitaux ou même au niveau des voies aériennes supérieures ou pou mons. Lorsqu'il y a infection, c'est le système immunitaire qui prend en charge l'action de lutte et élimination de ces menaces.

1.1.1 Lesystèmeimmunit ire

Le système immunitaire regroupe tous les agents et stratégies de défense de l'organisme. Il a pour fo nction essentielle l'élimination des agents infectieux et la prévention des dommages qu'ils peuvent induire. Pour cela, il doit pouvoir les distinguer des

éléments appartenant à l'organisme. Chaque molécule issue du génome d'un organisme est

reconnue par c elui -ci comme faisant parti du " soi ». Au contraire, toute molécule étrangère

est reconnue comme du " non-soi ». Le système immunitaire doit pouvoir identifier les

molécules du " non-soi » et adapter sa réponse en fonction.

Ce système est constitué de deux catégories : l'immunité innée et l'immunité

adaptative. Selon la localisation et la nature de la menace, l'une, l'autre ou les deux

!(E!

str»tŽgies vont tre mises en »pplià»tionb 3ÕimmunitŽ innŽe t»ussi »ppelŽe immunitŽ

n»turel

les reprŽsente l» rŽponse non spŽàifique t»n8is que l» rŽponse »8»pt»tive se 8Žveloppe

immunit»ire »8»pt»tive est toujours initiŽe p»r l» prŽsenàe 8e molŽàules reàonnues

spŽà regroupent 8eux sous groupes 8e àellules : le premier est àonstituŽ 8es m»àroph»gesd

àontre lÕinfeàtion t»n8is que le seàon8 est àonstituŽ 8e lymphoàytesb X»rmi àes lymphoàytes

se trouvent les lymph oàytes *d les gr»n8s lymphoàytes

ˆ gr»nules t3ê3s et les lymphoàytes

qb

3es lymphoàytes * sont 8es lymphoàytes 8ŽveloppŽs 8»ns le thymusb 'ls peuvent tre

àl»ssŽs en 8eux types

selon leurs »àtivitŽs: les lymphoàytes * »ààessoires Ç helper È *hd

regroup»nt les àellules »i8»nt ˆ lÕ»àtivitŽ 8es lymphoàytes q ou 8es ph»goàytes

mononuàlŽŽsd et les lymphoàytes * àytotoxiques *àb 'ls p»rtiàipent »insi ˆ l» fois ˆ l»

rŽponse immunit»ire innŽe et »8»pt»tiveb

X»r leur sŽàrŽtion 8e àytokinesd molŽàules 8e sign»lis»tion interàellul»ired les

lymphoàytes *h »i8ent »u àontr™le 8es lymphoàytes qd p»rtiàipent »u 8Žveloppement

8Õ»nti

àorps et inter»gissent »veà les àellules ph»goàyt»iresb Xlus gŽnŽr»lementd àes

lymphoàytes àontr™lent les rŽponses immunit»iresb

3es lymphoàytes *à ontd qu»nt ˆ euxd une »àtion àytotoxique sur les àellules

tumor»les ou infeàtŽes p»r un virusb 3ors 8e lÕinfeàtion vir»le p»r exempled 8es molŽàules

propres »u virus vont tre prŽsentŽs ˆ l» surf»àe 8e l» àellule p»r 8es molŽàules 8u Momplexe

/»jeur 8ÕEistoàomp»ti7ilitŽ tM/Esb

3es lymphoàytes *à vont »lors les reàonn»"tre ˆ p»rtir

8e rŽàepteurs

Ç * àell reàeptor È *MD quÕils portent ˆ leur surf»àeb

3es gr»n8s lymphoàytes ˆ gr»nules t3ê3s sont 8es àellules ˆ »àtion àytotoxiqueb Ë

l» 8iffŽrenàe 8es lymphoàytes *àd leur reàonn»iss»nàe est non spŽàifiqueb Mes àellules sont

Žg»lement »ppelŽes àellules f»tur»l Filler tfFsb *out àomme les lymphoàytes *

àytotoxiquesd elles portent ˆ leur surf»àe 8 es rŽàepteurs reàonn»iss»nt les molŽàules 8u

M/Eb kelon l» molŽàule reàonnued une rŽponse »àtiv»triàe ou inhi7itriàe 8e lÕ»àtivitŽ 8e l»

àellule fF ser» 8ŽàlenàhŽeb 3orsque àette rŽponse est »àtiv»triàed les su7st»nàes àontenues

8»ns les gr»nulesd les perforines et gr»nzymesd sont li7ŽrŽes 8»ns l» syn»pse et lysent les

mem7r»nes 8es àellules ài7lesd qui sont ensuite ph»goàytŽesb

3es lymphoàytes q sont

ˆ lÕorigine 8u 8Žveloppement 8es »ntiàorpsb CŽveloppŽs

8»ns l» moelle osseused àh»que àellule est àonue pour ne porter ˆ s» surf»àe quÕun seul type

8e

8e sŽleàtion àlon»lesb 3es àellules àorrespon8»ntes sont »lors stimulŽes pour prolifŽrerd

rŽàepteursd solu7lesd 8»ns le sŽrumb 'ls sont »lors »ppelŽs »ntiàorpsb Ces àellules m»turŽes

m»is non 8iffŽrenàiŽes sont àonservŽes àomme mŽmoireb

3Õeffià»àitŽ 8e àe mŽà»nisme est renforàŽe ˆ àh»que àont»

3orsquÕun type 8Õ»ntiàorps est 8ŽveloppŽd àeux ài vont reàonn»"tre et se lier »ux

e ou 8Õun »gent infeàtieuxb Mette simple inter»àtion

lÕ»ntiàorps v» pouvoir tre reàonnue p»r 8Õ»utres àellules 8e 8Žfense port»nt les rŽàepteurs

spŽàifiques

et permettre »insi lÕ»tt»àhement 8e àelles àib xlles pourront ensuite pren8re en

àh»rge lՎlimin»tion 8e l» men»àe »veà une effià»àitŽ »ugmentŽed puisque mieux »nàrŽes

8»ns lÕenvironnement 8e lÕ»gent infeàtieuxb

5858< +")*-'(&%1$=)**

3es »ntiàorpsd ou immunoglo7ulines t'gsd sont 8es molŽàules 8e reàonn»iss»nàe 8Ôun

CŽveloppŽs p»r les lymphoàytes qd àes glyàoprotŽines se trouvent li7res d solu7lesd

3e p»r»tope est portŽ p»r l» p»rtie v»ri»7le 8e lÕ»ntiàorpsb 3e reste 8e s» struàture est

àonst»nte

et rel»tivement àonservŽeb 'l existe àinq types 8Õ'g àl»ssŽs selon l» sŽquenàe 8e

àette p»rtie àonst»nte

: 'g/d 'gCd 'gêd 'gx et 'gAb

VObJMKS!dJPMJ\ZS!@;

La structure basique d'un an

ticorps est illustrée en légère est associée à l'une des chaînes lourdes, également par des ponts disulfures. Le Fc

comprend les domaines C H2 et C H3 des deux chaînes lourdes. Chacun des deux Fab est composé des domaines C H1 , V H , C L et V L . La structure des domaines variables et constants, fortement similaires, appartient à la famille des repliements de type " immunoglobuline ». Ce type de repliement consiste en deux feuillets ! antiparallèles. Les deux structures sont présentée s en déterminantes de la complémentarité CDR formant le site de liaison à l'antigène. Le CDR1

est la boucle située entre le brin B et C, le CDR2 entre le C' et C'' et le CDR3 entre les brins F et G. Le CDR3 est généralement le plus long et, dans la majorité des cas, est impliqué

dans l'interaction avec l'épitope de l'antigène. Le Fc quant à lui est reconnu par des

récepteurs spécifiques portés par certaines cellules de défense.

JQQJPLMSKKSKL! JT! PSQZMSbSKL! VS! LgQS! h!MbbTKO]ZO\TZMKS!i)!j!]JTNXS_! ZS! VObJMKS! dJPMJ\ZS! 7! `STMZZSLR!k!SL! LPOMR!

De nos jours, de plus en plus de stratégies de traitement de maladies rares ou cancer sont développées à partir de l'utilisation d'IgG. La production d'anticorps monoclonaux

mAbs dirigés contre des cibles d'intérêt sert à la fois à la prévention, à la détection et au

traitement en lui -même. Les anticorps, sous leur forme de Fab, ont beaucoup été utilisés comme outils de détection et diagnostique depuis leur découverte, du fait de leur reconnaissance spécifique d'antigènes. Pourtant, la taille imposante de cette protéine (150 kDa) présente des inconvénients : elle limit e sa pénétration et biodistribution. De plus, son activité est rapidement neutralisée par le système immunitaire et sa durée de vie est de quelques jour s.

Un nouveau

type d'anticorps a été découvert au début des années 1990. Ces anticorps ont été trouvés dans le sérum de camélidés, incluant les lamas et chameaux, en plus d' anticorps IgG classiques. Ils ont été nommés anticorps de chaîne lourde HcAbs, dû à l'absence de chaîne légère (2)

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